[发明专利]一种以壳寡糖为佐剂的鸭疫里默氏菌菌影疫苗

说明书

本发明的目的在于提供了一种装载具有干扰素诱导活性的聚肌胞苷酸，并加入壳寡糖作为佐剂的鸭疫里默氏菌菌影疫苗。该方案首先构建温控表达载体，电转化入鸭疫里默氏菌原生质体，筛选阳性克隆后28℃增菌培养，然后42℃诱导裂解基因的表达，待OD₆₀₀不再降低时，加入聚赖氨酸继续作用以充分裂解活菌，然后离心分离菌体。将干燥菌体与6mg/mL的聚肌胞溶液等比例混合，使聚肌胞包埋进入菌影内，然后加入2%壳寡糖水溶液搅拌形成均一的混合物，分装于西林瓶，冷冻干燥，即得到鸭疫里默氏菌新型菌影疫苗。本发明所制备的菌影疫苗经饮水免疫，既可以刺激呼吸道和消化道黏膜的局部免疫，也可以激发体液免疫，对机体的保护效果与注射免疫无明显差异。

技术领域

本发明属于兽用疫苗生产领域，涉及一种鸭用细菌疫苗的制备方法，尤其是涉及一种以壳寡糖为佐剂的鸭疫里默氏菌菌影疫苗的制备方法。

背景技术

鸭疫里默氏菌(Riemerella Anatipestifer,RA)主要侵害2-7周龄雏鸭，以神经症状和纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征，是目前危害养鸭生产的主要细菌性传染病之一。该病可通过呼吸道、消化道及皮肤创伤感染，并常常与大肠杆菌、副黏病毒等病原形成混合感染，引起鸭的大批死亡。

鸭疫里默氏菌虽然对一些抗生素敏感，但机体内难以完全清除；同时由于抗生素的不合理使用，其耐药性日益普遍，一方面加大了抗生素治疗的难度，另一方面往往导致禽产品的药物残留问题日益突出。防控该病的科学方法，是在强化饲养管理的基础上，接种适宜的鸭疫里默氏菌疫苗。

目前关于鸭疫里默氏菌的疫苗方面已经有一些研究报道，例如，鸭疫里默氏菌灭活苗、二价复合佐剂灭活疫苗等。细菌经过灭活，其细胞表面的结构往往被破坏而影响抗原性，不能刺激机体产生较为全面的保护。近年来，疫苗制备方面开展了新型菌影(或菌蜕、鬼影)的许多研究，解决了保持细菌外表完整性的问题。该方面的研究在鸭疫里默氏菌也有一些报道，证实利用该方法制备的菌影疫苗具有较高的保护率。动物的主要感染途径是呼吸道和消化道，呼吸道、消化道表面的黏膜免疫屏障(以分泌型免疫球蛋白SIgA为代表)是抵御病原感染的第一道屏障。由于鸭疫里默氏菌制备成菌影后基本丧失了在呼吸道的定殖能力，所以不能产生局部免疫，只能通过注射免疫动物，因而仍然存在以下几方面的问题：①通过注射免疫，给动物造成很大的免疫应激，往往引起副黏病毒、大肠杆菌乘虚而入，导致严重的继发感染。②灭活苗只能引起体液免疫，不产生或仅产生轻微局部黏膜免疫，不能提供可靠的抵抗感染的黏膜免疫屏障。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种装载具有干扰素诱导活性的聚肌胞苷酸，并加入壳寡糖作为佐剂的鸭疫里默氏菌菌影疫苗。本发明所提供的技术方案对有效防治鸭疫里默氏菌感染，以及减少家禽养殖过程中抗菌药物的使用、减少药物残留等具有重要意义。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：

选择本实验室鉴定保存的2型鸭疫里默氏菌临床分离株(编号为WF1)作为基础菌株。冷冻保存的菌种复苏后，按常规试验方法制备成原生质体备用。

利用常规分子生物学技术，将噬菌体PhiX174的E基因(简称E)与金黄色葡萄球菌核酸酶A基因序列(SN)通过15个柔性氨基酸串联为E-SN双基因，然后与温控表达载体pBV220连接，构建温控表达载体pBV-E-SN。将该表达载体按常规试验方法电转化前述制备的鸭疫里默氏菌原生质体，筛选阳性克隆得到鸭疫里默氏菌工程菌。

将得到的鸭疫里默氏菌工程菌常规方法28℃增菌培养，生长至OD₆₀₀至0.6～0.7时迅速升温至42℃诱导裂解基因的表达。当OD₆₀₀不再降低时，降温至37℃于菌影中按9:1的比例加入10μg/mL的聚赖氨酸在37℃条件下作用24h，以充分灭活残存的活菌而不破坏其表面结构。菌体抽样，稀释后涂平板检测，无活菌生长的判定为合格。然后离心分离菌体，冷冻干燥。