[发明专利]一种与α‑鹅膏毒肽特异结合的核酸适配体及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种与α-鹅膏毒肽特异结合的核酸适配体及应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

核酸适配体是一类能与靶分子特异性、高亲和力结合的寡核苷酸分子（DNA或RNA），可通过SELEX技术，从特定的寡核苷酸库中筛选得到。由于其具有靶分子范围广、分子质量小、免疫原性低、易于化学合成、改造和标记等优点，核酸适配体在临床诊断鉴定和疾病治疗等领域中具有重要的应用价值。

鹅膏菌毒素（amanitin）是从毒蘑菇中分离出来的一种多肽类物质，其中以α-鹅膏毒肽的毒性最强（α-amanitin）。人若误食含有α-鹅膏毒肽的鹅膏菌(Amanita)后，轻者可产生腹泻、腹痛、呕吐，重者可出现幻觉、昏迷等多种症状，致死率较高。α-鹅膏毒肽是从鹅膏菌中分离出来的一种八肽化合物，它是RNA聚合酶II 的专一性抑制剂，能抑制真核细胞RNA 聚合酶II 的活性，从而阻碍mRNA 转录和蛋白质的合成，这也是引起鹅膏毒素中毒，导致死亡的主要因素。因此，利用SELEX技术筛选α-鹅膏毒肽的特异性核酸适配体，进而及时、快速检测出食用野生菌中是否含有鹅膏毒素，对于降低误食蘑菇中毒及诊断治疗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；该核酸适配体为单链DNA，由84个核苷酸组成，拓扑学结构为直链状；预测的二级结构具有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-14.901。

本发明另一目的是将与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体应用在识别α-鹅膏毒肽或在制备检测α-鹅膏毒肽的试剂盒中。

本发明的技术方案如下：

1、α-鹅膏毒肽特异性核酸适配体（E06）的筛选、克隆、分离和测序

采用SELEX技术筛选出能够与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体群体，设计引物进行PCR扩增、克隆、分离和测序。利用酶联寡核苷酸吸附试验（ELONA）进行验证，得到适配体E06，它能够高亲和力高特异性的结合α-鹅膏毒肽。配体接头引物序列为：Aptamer Fw: GACATATTCAGTCTGACAGC；反向互补序列：CGCTGTCAGACTGAATATGTC；Aptamer Rv: GCTAGACGATATTCGTCCATC，反向互补序列：GATGGACGAATATCGTCTAGC。所获阳性单克隆进行核苷酸序列测定，测序结果表明与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体(E06)由84个核苷酸组成，其序列（5’端至3’端）为：

tgacatattc agtctgacag cgtactgtcg actattgggc ggtatgggga caacattgcg ttgatggacg aatatcgtct agca ；

2、核酸适配体（E06）单链DNA二级结构表征

使用MFOLD软件（http://mfold.rna.albany.edu/q=mfold/DNA-Folding-Form）对与α-鹅膏毒肽特异性结合的核酸适配体E06单链DNA分子进行二级结构预测，结果表明，其二级结构具有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-14.901，显示该结构具有较高的稳定性；其二级结构如下：

。

、核酸适配体（E06）的特异性和对α-鹅膏毒肽的敏感性

根据核酸适配体E06的序列，用体外转录方法合成生物素标记的核酸适配体，建立了一种新型的酶联寡核苷酸检测方法，通过此方法对E06的特异性和其对α-鹅膏毒肽的敏感性进行检测；结果显示，E06具有很高的特异性，其能检测到蘑菇毒素α-鹅膏毒肽的最低浓度为20 μg/mL。

本发明的意义在于:

利用SELEX技术筛选出的配体E06能够高亲和力高特异性的识别并结合α-鹅膏毒肽；核酸适配体E06的鉴别对于食用野生菌中α-鹅膏毒肽的检测，进而降低α-鹅膏毒肽对人体的侵害具有重要意义。

附图说明

图1为本发明中核酸适配体E06的特异性分析，图中：空白对照为α-鹅膏毒肽+脱脂奶；阴性对照：α-鹅膏毒肽+不含配体的生物素；非靶标蛋白：生长抑素八肽+标记有生物素的配体E06；α-鹅膏毒肽40 μg/mL：α-鹅膏毒肽+标记有生物素的配体E06；

图2为本发明中核酸适配体E06的灵敏度分析，图中：空白对照：α-鹅膏毒肽+脱脂奶；阴性对照：α-鹅膏毒肽+不含配体的生物素；配体 E06：α-鹅膏毒肽+标记有生物素的配体E06。

具体实施方式