[发明专利]表达量提高的突变葡萄糖氧化酶及其编码基因和应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体涉及表达量提高的突变葡萄糖氧化酶及其编码基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明采用定点突变技术将黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)的葡萄糖氧化酶(GOD)基因(Genebank:FJ979866.1)进行定点突变，使其氨基酸序列突变位点为Y76C和Q279K；将突变基因克隆连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA，转化Pichia pastoris X33，筛选得到表达量提高的葡萄糖氧化酶毕赤酵母菌株P.pastoris X33‑pPICZαA‑GODmut；酶学性质测定表明，突变的葡萄糖氧化酶基因能在毕赤酵母中稳定、高效的表达及遗传，突变菌株所表达的葡萄糖氧化酶的酶活性以及稳定性显著高于出发菌株。这为葡萄糖氧化酶的大规模生产奠定了良好的基础。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及表达量提高的突变葡萄糖氧化酶及其编码基因和应用。

背景技术

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)在有氧条件下能专一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。GOD是同型二聚体分子，含有2个黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD) 结合位点。每个单体含有2个完全不同的区域：一个与部分FAD非共价但紧密结合， 主要为声折叠；另一个与底物β-D-葡萄糖结合，由4个α-螺旋支撑1个反平行的β -折叠。GOD广泛分布于动植物和微生物体内。由于微生物生长繁殖快、来源广，是 生产GOD的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。

GOD已被广泛应用于食品、饲料、医药等领域，目前国外生产的GOD厂家主要是德国的Boehringer和日本的TOYOBO。产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制。

本发明采用定点突变技术将黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)的葡萄糖氧化酶(GOD)基因(Genebank:FJ979866.1)进行定点突变，使其氨基酸序列突变位点为Y76C和Q279K；将突变基因克隆连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA，转化Pichiapastoris X33，筛选得到表达量提高的葡萄糖氧化酶毕赤酵母菌株。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种表达量提高的突变葡萄糖氧化酶GOD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MQTLLVSSLVVSLAAALPHYIRSNGIEASLLTDPKEVAGRTVDYIIAGGGLTGLTTAARLTENPDITVLVIESGSCESDRGPIIEDLNAYGDIFGSSVDHAYETVELATNNQTALIRSGNGLGGSTLVNGGTWTRPHKAQVDSWETVFGNEGWNWDSVAAYSLQAERARAPNAKQIAAGHYFNASCHGINGTVHAGPRDTGDDYSPIVKALMSAVEDRGVPTKKDLGCGDPHGVSMFPNTLHEDQVRSDA AREWLLPNYQRPNLQVLTGQYVGKVLLSKNATTPRAVGVEFGTHKGNTHNVYAKHEVLLAAGSAVSPTILEYSGIGMKSILEPLGIDTVVDLPVGLNLQDQTTSTVRSRITSAGAGQGQAAWFATFNETFGDYAEKAHELLNTKLEQWAEEAVARGGFHNTTALLIQYENYRDWIVKDNVAYSELFLDTAGVASFDVWDLLPFTRGYVHILDKDPYLRHFAYDPQYFLNELDLLGQAAATQLARNISNSGAMQTYFAGETIPGDNLAYDADLSAWVEYIPYNFRPNYHGVGTCSMMPKEMGGVVDNAARVYGVQGLRVIDGSIPPTQMSSHVMTVFYAMALKIADAILADYASMQ.

本发明的再一目的是提供编码上述突变葡萄糖氧化酶GOD的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2: