[发明专利]鉴定样品中微生物种类的方法及其试剂盒

说明书

本文公开了具有用于鉴定样品中多个的微生物的独特设计的寡核苷酸引物的组合物，和用来从不同的生物与环境样品中检测微生物群体的改进的方法。

序列表的纳入

序列表是ASCII文件夹中的30587_ST25.txt文件，大小19KB，2014年4月24创建，通过EFS-Web提交到美国专利商标局，在本专利中作为引用文献纳入。

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及鉴定样品中微生物种类的组合物和方法。

背景技术

全球近乎10³⁰的微生物基因组，在不同的环境和宿主环境中，微生物群系之间和系内的多样性众所周知(Huse et al.,PLoS Genetics 4(11):e1000255(2008)).因为复杂的多样性，确定微生物群系的组成对于现有的技术是一个挑战。首先，自然界中只有很少的微生物可以成功培养，其次测序条件等也面临着挑战。在一个微生物群系中不同的微生物组成以及它们之间的同源性使确定它们的种类很困难。

原核生物的核糖体由两个亚基组成：30S的小亚基和50S的大亚基，共同组成了70S的核糖体，其中S是沉降速度单位。30S的小亚基是由16S核糖体RNA和21种蛋白质组成的，而50S的大亚基包含5S和23S两种核糖体RNA。16S rRNA基因的超变区序列可以用来鉴定细菌的种类。16S DNA序列在微生物学研究中普遍用来鉴定原核生物和其他生物的多样性及它们之间的进化关系。

微生物的16S RNA基因被用来鉴定不同环境比如土壤和胃肠道样品中的微生物种类。然而如何提高微生物的检测，比如提升在少量样品中微生物的检测能力，利用16S高保守和低保守序列鉴定和区分微生物，提高测序的精确性等都是需要解决的问题。

发明内容

本专利公开的是用来鉴定一个样品中多个微生物的上游引物组合和下游引物组合。每个引物组合包括一条或多条引物，至少一个引物组合中是包括多条引物序列的。每条引物中有域-特异性序列能够结合到细菌或古生菌核糖体16S DNA V3，V4，或V5附近的保守结构域域。每条引物同时又是多重引物，这些多重引物之间相互重合并能结合到相同的保守结构域域，每条引物至少和另一条引物域特性序列的5’端有1-3个核苷酸的移码，因此在聚合酶链式反应(PCR)中通过上下游引物的组合其产物也是移码的。

同一个引物组合中的每条引物在结构域特异性序列的5’起始点旁边含有至少一个随机碱基。引物组合中的每条引物的结构域特异性序列中包括至少一个简并碱基。有些例子中，上游引物和下游引物都有多条相互间有重合的引物。

本发明得到的扩增子包括(i)V3-V4区；(ii)V4-V5区；(iii)V4区和(iv)V3,V4,V5区.

例如，上游引物组合中每条引物的结构域特异性序列能够结合在16S DNA的C2结构域，下游引物组合中每条引物的结构域特异性序列能够结合在16S DNA的C4结构域。这些引物组合起来可以扩增出16S DNA的V3-V4区。又如：上游引物组合中每条引物的特异性序列能够结合在16S DNA的C3结构域，下游引物组合中每条引物的特异性序列能够结合在16SDNA的C5结构域.这些引物组合起来可以扩增出16S DNA的V4-V5区。

在这些例子中，为了保证序列的成功测序，本专利公布的引物含有部分接头序列。在这些反应当中还含有一对接头引物能够和上述引物中的部分接头序列互补，以及含有一对通用引物能和接头引物互补。