[发明专利]烟草赤星病的人工接种方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物保护领域的病菌接种方法，特别涉及烟草赤星病的人工接种方法。

背景技术

烟草赤星病是由链格孢菌(Alternaria alternata Fries Keissler)引起的一种叶部真菌病害，发生于烟草生长中后期，是烟草生产上威胁较大的病害之一。该病具有潜育期短、流行速度快的特点，在适宜的环境条件下，短时间内即可造成大流行，给烟叶生产带来巨大损失。自20世纪90年代以后，我国烟草赤星病的发生逐年上升，且愈趋严重，成为主要的侵染性病害之一。因此，科学的控制赤星病是生产上亟待解决的问题。利用抗病品种是防治烟草赤星病最为有效的措施，这就有必要确定赤星病病菌的致病性强弱及优势菌群，并进行烟草种质资源与品种抗病性鉴定与筛选工作。这其中就牵涉到快速、简便、有效的人工接种方法，

因为依靠田间自然发病鉴定，调查困难，费时费力，周期长，而温室接种试验场地较为费工，人工接种法可节省菌液、劳力、试材和设备，且环境条件可控、稳定，不受干扰，接种简单、发病快速、结果更为准确可靠，因此探索出室内人工接种赤星病菌的适宜方法，是对快捷有效的测定病原菌的致病力及筛选赤星病抗病品种，具有很好的应用价值。

接种是证病过程的重要环节，是研究赤星病病原致病性、发病规律、侵染途径、品种(材料)的抗性鉴定及控制病害等方面的有效保障，特别是在品种对烟草赤星病的抗性研究中，对所鉴定品种进行人工接菌诱发病害发生是品种抗性筛选研究不可缺少的手段和方法。目前，已报道的赤星病菌人工接种方法主要有菌丝块接种法(董汉松，曲建军，吕士恩等.烟草赤星病菌孢子萌发和侵染条件的研究山东科学1993(2)：30-35)、菌丝悬滴接种法(沈奕，高智谋，杜雷等.烟草赤星病菌苗期人工接种方法的研究安徽农业大学学报2009,36(3)：356-359)、孢子悬滴法(张世才.重庆烟草赤星病菌的致病力分化及遗传差异性研究.2009,西南大学硕士学位论文)、孢子液棉球法(成巨龙，孙渭.烟草不同发育阶段对赤星病的抗性表现与综合防治技术.植物保护学报2001,28(1):44-48)及喷雾法(焦天雷.烟草(Nicotiana tabacum L.)赤星病抗性QTL的定位分析.2011,浙江大学硕士学位论文)；但在试验中发现，利用上述几种不同方法进行赤星病病菌接种时，对赤星病的发病程度影响差异很大，且出现了接菌不发病或发病不理想的问题，接种方法的不成熟会限制了病原菌与寄主互作研究工作的开展。

发明内容

为了弥补以上领域的不足，本发明提供了烟草赤星病菌的人工接种方法。

本发明所提供的烟草赤星病菌的人工接种方法，包括如下步骤：

(1)取烟草叶片，表面经流水冲洗洁净后，取接种点，用针头刺破接种点部位的叶片，制造伤口准备接种；

(2)用注射器吸取烟草赤星病菌的分生孢子液，从所述烟草叶片正面的接种点处注入叶肉组织内，得到接种后的烟草叶片；所述分生孢子液的浓度为1×10⁵孢子/mL～1×10⁷孢子/mL；所述烟草赤星病菌的菌龄为5天～15天；

(3)将所述接种后的烟草叶片的叶基处保湿，并置于28～30℃的条件下黑暗培养8小时后，再进行12小时光照黑暗交替培养；培养7～15天。

所述步骤(1)中所述烟草叶片为烟草植株下部的成熟叶片。

所述烟草植株下部的成熟叶片为烟株下部倒数第3片叶。

所述步骤(2)中所述分生孢子液的浓度为1×10⁶孢子/mL。

所述步骤(2)中所述烟草赤星病菌的菌龄为10天或15天。

所述步骤(2)中所述接种的量为10μL。

所述步骤(3)中所述烟草叶片的叶基处保湿为用浸泡无菌水的脱脂棉球保湿，并用保鲜膜覆盖保湿。

本发明所提供的烟草赤星病菌(链格孢菌)致病性测定的室内人工接种方法，结果表明，利用赤星病菌孢子悬浮液经离体叶片伤口注射对成熟叶片进行接种，病菌的分生孢子可以直接进入叶片内，借助水分及寄主叶肉组织营养萌发、扩繁，向细胞间扩展，局部组织死亡形成的病斑会得到大面积扩大。可达到接种率高，发病程度适中的效果，这为鉴定我国烟草主产区不同赤星病菌致病性及小种差异及烟草赤星病抗性品种的筛选提供了一种简易、方便、快速、准确的人工接种方法，具有较好的应用价值。

附图说明

图1为离体叶片伤口注射法接种后10d寄主发病情况；CK：无菌水对照；A，B：供试赤星病菌孢子悬浮液接种。

图2为15d时接种叶片发病典型症状。