[发明专利]超支化固定金属亲和色谱固定相及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种超支化固定金属离子亲和色谱固定相及其制备方法。

背景技术

蛋白质作为生命的物质基础，对生命活动有着重要的意义。随着生物科技的发展，对一些医疗产品如抗生素，疫苗，抗体，多肽，治疗性蛋白质等的分离与纯化变得越来越重要。然而蛋白质等生物大分子一般以复杂混合物的形式存在，且具有特殊性质，如对温度，酸碱度，有机溶剂敏感等问题，仅根据其理化性质分离几乎不能取得很好的效果。亲和色谱是一类在分离介质上修饰合适的配基，与蛋白进行特异性结合而实现蛋白纯化的方法，特异性高，应用广泛。作为亲和色谱的一种，固定金属亲和色谱由于其选择性好，重现性高，分辨率高，广泛用于含组氨酸标签蛋白分子的特异性识别与分离。当以膜材料作为色谱固定相时，由于其压降小，轴向扩散路径短，容易扩大生产等优点，成为近几年的研究热点。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种超支化固定金属离子亲和色谱固定相。

本发明另一目的是提供超支化固定金属离子亲和色谱固定相的制备方法，以表面含有羟基的色谱固定相为基质，利用超支化的方法对材料进行表面改性，在膜表面引入大量氨基后，再通过环氧基引入氨基羧酸配基，最后螯合金属离子，成功制备超支化固定金属离子亲和膜。

本发明还进一步提供了上述材料的应用，将该制备的固定化金属亲和色谱固定相用于纯化蛋清中溶菌酶。

本发明实现过程如下：

结构式（I）所示的超支化固定金属亲和色谱固定相，

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结构式（I）所示的超支化固定金属亲和色谱固定相的制备方法，包括如下步骤：

(1) 色谱固定相预处理：将色谱固定相经甲醇浸泡去除表面油脂及粘附杂质，用甲醇和水反复洗涤干燥，所述的色谱固定相为硅胶、壳聚糖或表面修饰有硅羟基的磁性纳米材料；

(2) 色谱固定相表面氨基化：将色谱固定相先与环氧氯丙烷反应，然后与三-（2-氨基）乙基胺反应得到氨基化色谱固定相；

(3) 将氨基化色谱固定相依次与丙烯酸甲酯和乙二胺通过迈克加成反应和酰胺化反应在膜表面形成超支化结构；

(4)最后引入IDA型配基：将步骤（3）制备的超支化色谱固定相与环氧氯丙烷反应引入环氧基，进一步与氨基羧酸反应使膜表面产生IDA型金属螯合配基；

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螯合有金属离子Co²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺、Ga³⁺、Zr⁴⁺或Ti⁴⁺的超支化固定金属亲和色谱固定相。例如以螯合Cu²⁺为例，将色谱固定相浸入10mM CuSO₄溶液，于摇床中室温吸附12h，使其充分与Cu²⁺螯合，再用 pH=5 NaAc-HAc 缓冲液多次洗涤，水洗，除去色谱固定相表面未螯合的Cu²⁺。

结构式（I）所示的超支化固定金属亲和色谱固定相在蛋白分离与纯化中的应用，当超支化固定金属亲和色谱固定相螯合Co²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺或Ni²⁺时，用于His-tagged 蛋白的分离与纯化。螯合Fe³⁺、Ga³⁺、Zr⁴⁺或Ti⁴⁺的超支化固定金属亲和色谱固定相可应用在富集磷酸化钛。

本发明的优点如下：

(1)本发明色谱固定相可采用可再生纤维膜为基质，纤维素属于天然高分子，是一种可再生资源，且具有良好的亲水性，耐污染性，可降解性及生物相容性，具有潜在的应用价值；

(2)本发明采用超支化方法对色谱固定相进行表面改性，通过在表面引入更多的功能基团，增加吸附点来提高蛋白的吸附量，制备了一种对金属离子和蛋白都有较高吸附量的固定金属亲和色谱固定相；

(3)本发明制备的超支化色谱固定相用于纯化蛋清中的溶菌酶时，回收率可达94.3%，比未超支化的固定金属亲和色谱固定相的回收率提高了50%；