[发明专利]一种携带KAL基因重组腺相关病毒载体的基因治疗药物

说明书

技术领域：

本发明涉及一种利用重组腺相关病毒载体的基因治疗药物。

背景技术：

目前在我国，肺癌是危害人民健康的恶性肿瘤之一，标准化放、化疗治疗的肺癌患者，平均生存期为28.7个月，是威胁病人生命的头号杀手！随着生物技术的不断发展，基因药物逐渐成为人们关注的一种新治疗手段。所说基因药物，是指利用基因序列数据，经生物信息学分析、高通量基因表达、高通量功能筛选和体内外药效学研究开发得到新药候选物。Kallistatin(KAL)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，能特异性与血浆型激肽释放酶结合而不与组织型激肽释放酶结合的蛋白，存在于多种组织和体液中，是人体内源性血管生长抑制因子，具有抗炎、抗氧化、抗高血压、抗肿瘤等作用。目前，多个实验室开展了KAL的抗肿瘤实验研究，涉及的肿瘤包括乳腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌和肺癌等。虽然已有报道称，利用kallistatin蛋白或者含有kallistatin基因的质粒针对肺部肿瘤的治疗，不过，存在半衰期较短、需要短期内高剂量持续给药等问题困惑，因此迫切需要寻找一种肺癌靶向的、能长效表达的载体，用于携带kallistatin基因，更好地发挥治疗肺癌的作用。

为了更好地解决上述问题，本实验室选用了具有广泛宿主范围、能够介导外源基因长期表达、安全性能好、在人类没有致病性、可以转染分裂或者非分裂的哺乳动物细胞并有肺部靶向的9型重组腺相关病毒载体(rAAV9)[Michelfelder,S.等，PLoS One，2011,6(8)：e23101；Zincarelli,C.等,Mol Ther,2009,16(6):1073-1080；Bell,C.L.等,J Clin Invest,2011,121(6):2427-2435；Walia,J.S.Mol Ther.2015，,2(3):414-422]。本发明所述将rAAV9载体携带kallistatin的cDNA，腹腔注射到人肺癌荷瘤鼠体内，以PBS为阴性对照，以顺铂为阳性对照，观察49天，发现rAAV9-KAL能明显抑制肿瘤的增殖。本发明提供的治疗肺癌基因药物rAAV9-KAL，迄今尚未见有国内外的相关报道。

发明内容：

本发明提供的肺癌治疗基因药物(rAAV9-KAL)，包括以下步骤：

(1)基因重组质粒是含kallistatin的cDNA基因，基因表达框两端为AAV2血清型的末端反向重复序列(inverted ter min al repeat，ITR)、牛生长激素poly A元件(bovine growth hormone polyadenylation signal，BGH poly A)，其中还含有氨苄青霉素选择元件AMP，土拨鼠肝炎转录后调控元素WPRE(Woodchuck hepatitis Post-transcriptional Regulatory Element)增强子，CAG chickenβ-actin promoter启动子。载体质粒是血清型AAV2的rep基因，AAV9的cap基因。

(2)三质粒磷酸钙转染法生产rAAV9-KAL，采用CHT色谱联合ANX色谱进行纯化。

(3)建立肺癌荷瘤鼠模型，采用腹腔注射形式进行给药，每周观察记录肿瘤大小，7周后通过肿瘤体积，重量以及kallistatin蛋白表达情况，评价rAAV9-KAL的抗肿瘤效果。

其中：所述肺癌治疗用rAAV9-KAL剂量，选自1×10²VG/mL到1×10¹⁶VG/mL的任意一个；给药途径适用腹腔注射、静脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、口服等。

本发明所述的rAAV基因药物，不仅可以治疗移植性肺癌，也可以用于原位肺癌。

本发明所述的rAAV基因药物，可以用于肝癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤。

本发明所述的rAAV基因药物，不仅适用于rAAV9型载体，也适用于其他血清型载体rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAV11、rAAV12等。

本发明所述的rAAV基因药物，不仅适用于单链rAAV载体，也适用于双链rAAV载体。

附图说明：

图1.不同血清型rAAV-KAL的体外抗肿瘤作用

图2.不同给药途径的kallistatin蛋白表达量

图3.不同血清型rAAV-KAL对皮下移植肿瘤作用

图4.单双链rAAV-KAL抗肿瘤作用