[发明专利]一种甘蓝子叶培养高频分化体系建立方法

说明书

技术领域

    本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种甘蓝子叶培养高频分化体系建立方法。

背景技术

甘蓝(Brassica oleracea L.)又称结球甘蓝、包心菜、洋白菜、圆白菜、茴

子白、椰菜等，是十字花科芸薹属甘蓝种形成叶球的一个变种，二年生草本植物。甘蓝具有重要营养价值和医用作用，其中甘蓝的维生素C含量在蔬菜

中位居前列。结球甘蓝味甘，性平，归脾，胃经；能医脾和胃，缓急止痛；能防治胃、十二指肠溃疡病；能增强人体内苯并芘与甲基蒽对致癌物质的抵抗力。甘蓝类蔬菜在世界各地普遍种植，尤其在欧美栽培较多。由于其具有适应性广、耐寒和耐热性较强、病害少、产量高、营养丰富、耐贮运等特点，在我国各地普遍种植。

    植物组织培养技术是获得整齐一致材料的快捷途径，目前国内外对甘蓝离体培养的研究己经有了一定的基础,但至今未能应用于生产实践。本发明以甘蓝种子为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织诱导、丛生芽诱导、增殖、生根诱导等过程建立了甘蓝子叶培养高频分化体系，为甘蓝的工厂化生产和推广应用提供了技术支持。

发明内容

    本发明以甘蓝种子为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织诱导、丛生芽诱导、增殖、生根诱导等过程建立了甘蓝子叶培养高频分化体系，从而实现了本发明的目的。

本发明的一种甘蓝子叶培养高频分化体系建立方法，包括以下的步骤：

（1）无菌苗的制取：选择甘蓝种子先用洗衣粉水浸泡10～30min,再用自来水漂洗干净,然后置于超净台上,用75%酒精消毒30～60s,再用0.1 %升汞溶液消毒10～30min，无菌水冲洗4～6遍后消毒滤纸吸干水分后置于MS培养基中，放入培养箱中进行发芽培养，温度为 25℃，3天统计污染率，7天统计发芽率和污染率。

    （2）愈伤组织诱导：将步骤（1）培养获得的 5～7天苗龄的无菌苗，切取带1～2mm 子叶柄的子叶接种于诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养。接种后先黑暗条件下培养，待出现愈伤组织后再移至置于每天光照12～14小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计诱导率。

   （3）丛生芽诱导：将步骤（2）诱导得到的愈伤组织转接至芽诱导培养基中进行诱导分化培养。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计分化情况。

    （4）增殖培养：将步骤（3）诱导培养得到的丛生芽从基部切下并转接到增殖培养基中进行继代。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计增殖情况。

    （5）生根培养：将经步骤（4）分化培养得到的无根试管苗转接至生根培养基中进行生根。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计生根情况。

（6）炼苗移栽：试管苗生根20天后，具备发达健壮的根时将组培苗不揭瓶盖在自然光下炼苗7天。移栽时用镊子从瓶中取出组培苗,小心洗净基部残留的培养基,选择健壮苗移栽到消过毒的轻基质中，浇足水,遮荫处理。移栽后经常喷水,保持空气湿度。植株成活后转入正常土壤中定植。

    上述步骤（2）所述的诱导培养基为：MS+3.0～6.0mg/L 6-BA+ 0.1～1.0mg/L NAA+25～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

    上述步骤（3）所述的芽诱导培养基为：MS+1.0～3.0mg/L6-BA+0.1～0.3mg/LNAA+25～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

上述步骤（4）所述的增殖培养基为：MS+0.1～0.5mg/LNAA+3.0～6.0mg/L6-BA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

上述步骤（5）所述的生根培养基为：1/2MS+1.0～3.0mg/LIBA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。

本发明的优点是： 本发明以甘蓝种子为外植体，通过外植体消毒、愈伤组织诱导、丛生芽诱导、增殖、生根诱导等过程建立了甘蓝子叶培养高频分化体系，从而实现了本发明的目的。