[发明专利]一种基于合成单链DNA文库快速高效组合进化DNA的方法

权利要求书

1.一种快速高效组合进化DNA的方法，其特征在于，主要包括制备单链突变体文库、制备双链突变体文库、筛选突变体，单链突变体文库与双链突变体文库分开或同步构建；为构建单链突变体文库，针对亲本基因的各个目标突变区域，分别设计引物，各引物方向相同，并通过向PCR体系中添加DNA连接酶来连接各发生突变的核苷酸片段，得到完整的单链突变体；为构建双链突变体文库，单链突变体的两端需带上额外的锚点序列，便于在双链化时，设计用于特异性扩增单链突变体的引物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲本基因编码的内容不受限制，可以为启动子、核糖体结合位点或其他基因表达调控元件，或酶基因，或代谢途径基因。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲本基因的存在形式不受限制，可以为质粒、基因组、双链DNA片段或者单链cDNA。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链突变体文库和双链突变体文库同时构建，是直接向构建单链突变体文库的PCR体系中添加特异结合单链突变体的引物，边PCR获得单链突变体，边以单链突变体为模板进行双链化反应和双链突变体的扩增反应。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链突变体文库和双链突变体文库分开构建时，直接以含单链突变体文库的PCR混合物作为模板，不更换反应体系，直接向其中加入特异结合单链突变体的引物进行第二轮PCR制备全长完整的双链突变体；或者以经柱纯化回收后的单链突变体文库作为模板，重新配制反应体系进行第二轮PCR制备全长完整的双链突变体。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，为构建单链突变体文库，针对亲本基因的一个或多个目标突变区域，分别设计相应的引物，称为编辑引物；所述编辑引物含有需要向突变区域引入的突变碱基且3’和5’端分别有适当长度的与模板链匹配的序列；涉及多个突变区域时，各编辑引物为同方向，均与同一方向的模板链配对结合；另外设计两条与编辑引物同方向的锚点引物，其中一条是上游锚点引物，一条是下游锚点引物，所述上游锚点引物含有一段与模板链3’端匹配的核苷酸序列，此外，该上游锚点引物的5’端还有15-25bp的锚点序列；所述下游锚点引物含有一段与模板链5’端匹配的核苷酸序列，此外，该下游锚点引物的3’端还有15-25bp的锚点序列。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，需要进行突变的位点置于编辑引物的中间部位，根据需要可进行高度简并。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述锚点引物，还兼具编辑引物的功能，即在作为锚点引物的同时，还含有需要向突变区域引入的突变碱基。

9.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，为构建双突变体文库，以单链突变体作为模板，设计一对与锚点序列相匹配或相同的用于特异扩增单链突变体的外端引物，只有发生突变的单链DNA能与外端引物结合。

10.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，筛选突变体时，应用体外组装技术将双突变体与载体连接。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的体外组装技术为融合PCR、Gibson组装、T4DNA聚合酶介导的重组技术或者体内酵母组装技术。