[发明专利]一种高亮、高纯水溶性荧光分子及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于荧光分子染料制备与提纯技术领域，具体涉及一类柠檬酸与乙二胺及其相关衍生物或类似物通过水热法制备、再经柱层析或萃取提纯得到的高亮、高纯水溶性荧光分子及其制备方法。

背景技术

水溶性荧光分子可以作为生物组织的荧光探针，在生命科学领域有着十分重要的应用。许多类光学性能优良的荧光分子的水溶性不佳，如香豆素、罗丹明、荧光素等。虽然适当的修饰能够增加他们在水中的溶解度，但是这也增加了合成难度以及合成成本。且他们的结构复杂，往往具有较高的生物毒性。Alexa fluor染料是人类专门开发的系列荧光染料，以优异的荧光性能和水溶性为主要特点。但是它们的价格十分昂贵，以每毫克的价格为1000元左右。制备价格低廉的高亮的水溶性荧光分子一直是人们追求的目标。

发明内容

本发明的目的是提供了一类柠檬酸与乙二胺及其衍生物或类似物通过水热法制备、再经柱层析或萃取提纯得到的高亮、高纯水溶性荧光分子及其制备方法。

具体的，我们以柠檬酸和胺为原料使用简单的水热法制备并提纯了一系列高亮(各产物荧光量子产率高于70％)高纯(参见实施例的质谱或核磁数据)的水溶性荧光分子，即IPCA及其衍生物(R₁变化的产物)及其类似物(R₂变化的产物)。典型的物质结构如下式所示，R₁＝H为IPCA，R₁＝CH₃为Me-IPCA,R₁＝C₂H₅为Et-IPCA，R₁＝C₃H₇为Pr-IPCA，R₂＝H为PPCA。

对比市售荧光染料，我们的产品价格低廉，实验室制备IPCA成本仅为0.2元/g。产物的优点还包括，合成简单方便，具有明亮稳定的蓝色荧光，具有较好的荧光稳定性，含有活性集团(羧基)利于修饰与偶联，生物毒性低等(图1)。其在生物成像，荧光标记，荧光印刷等领域据有潜在应用。

通过L02细胞毒性实验，我们可以发现在培养液中加入浓度高达0.5mg/mL的IPCA或Et-IPCA培养48h后，细胞的存活率基本无降低。

本方法采用一步水热法，以柠檬酸与乙二胺及其衍生物或类似物为原料制备得到了荧光水溶液，再通过柱层析、萃取等提纯操作，分离出溶液主要发光成分——水溶性荧光分子。以柠檬酸和乙二胺为原料制备的荧光水溶液中分离的荧光分子命名为IPCA。以柠檬酸和N-甲基乙二胺、柠檬酸和N-乙基乙二胺、柠檬酸和N-丙基乙二胺、柠檬酸和1,3-丙二胺为原料，制备得到的荧光水溶液中分离的荧光分子为依次命名为Me-IPCA，Et-IPCA，Pr-IPCA和PPCA。

本发明所述的一种高亮、高纯水溶性荧光分子的制备方法，其步骤如下：

(1)称取柠檬酸固体粉末溶解于去离子水中，然后将乙二胺、乙二胺衍生物或乙二胺类似物加入到柠檬酸水溶液中并搅拌均匀，柠檬酸与乙二胺、乙二胺衍生物或乙二胺类似物的摩尔比为1：4～4：1；

(2)将步骤(1)溶液转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，在100℃～200℃条件下密闭反应2～10小时，反应结束后反应釜自然冷却至室温，即得到荧光水溶液；

(3)选取展开剂(如甲醇/乙酸乙酯，甲醇和乙酸乙酯混合溶液中甲醇的体积含量为50％～100％)对上述荧光水溶液进行柱层析分离，并通过旋蒸除去展开剂得到高纯度IPCA、Me-IPCA、Et-IPCA、Pr-IPCA或PPCA固体；或选用萃取剂(如乙酸乙酯)对上述荧光水溶液进行萃取，并通过旋蒸除去萃取剂得到IPCA、Me-IPCA、Et-IPCA、Pr-IPCA或PPCA固体。

步骤(3)所述的两种提纯方法各有优势：通过柱层析法分离得到的荧光分子纯度很高，而萃取法相对柱层析法则有操作简单易行的优点，利于规模化生产制备

附图说明

图1：IPCA和Et-IPCA的L02细胞毒性实验数据；

图2：IPCA的结构式以及质谱图；

图3：IPCA的核磁氢谱图；

图4：IPCA的核磁碳谱图；

图5：IPCA的红外谱图；

图6：IPCA水溶液不同激发下的发射谱；

图7：IPCA的最佳激发谱最佳发射谱和吸收光谱；

图8：IPCA的荧光寿命测试谱图；

图9：通过萃取分离的IPCA的核磁氢谱；