[发明专利]抗艾滋病药物筛选方法

权利要求书

1.抗艾滋病药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备模板和引物：在对HIV-1反转录起始被设计在RDDP活性和RT RNase H裂解活性的药物靶点，以RNA的PBS为模板、以PBS互补的DNA为引物；所述的PBS模板是2uL 1mM 21 nt HIV RNA template( 3’-ACAAGC CCGCG GUGAC GAUCU-5’)，所述的DNA引物为1uL 1mM 11 nt DNA primer (5’-γ-³²P-TGT TCG GGC GCC A-3’)；

（2）依次加入97 μL H₂O，70℃10 min，缓慢冷却到室温；

（3）取template/primer溶液1μL，依次加入缓冲液，水，DTT, dNTPS、药物、HIV RT；

（4）制备10μL 反应体系，template/primer的浓度为1uM，50 mM pH 8.0 tris-HCl， 60 mM KCl，8mM MgCl₂, 1mM DTT，500 mM dNTPS，0.5 U HIV RT，于37℃反应1h；

（5）通过丙烯酰胺电泳分离，Storm 840扫描，定量分析，计算药物的HIV RT抑制率。

2.根据权利要求1所述的抗艾滋病药物筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）中以21 nt PBS的HIV RNA基因组PBS作为模板，11 nt DNA作为引物，即细胞tRNA₃^Lys互补序列的一部分；

由DNA集成技术合成，其序列的选择如下：

11nt DNA引物：5’- TTCGGGCGCCA-3’

21 nt HIV RNA template: 3’-ACAAGCCCGCGGUGACGAUCU-5’

21nt HIV RNA模板：3’- ACAAGCCCGCGGUGACGAUCU-5’

11nt tRNA₃^Lys引物：11 nt tRNAlys3 primer: 5’-UUCGGGCGCCA-3’

5’- UUCGGGCGCCA-3’

14nt RNA-DNA引物：14 nt RNA-DNA primer: 5’-UUCGGGCGCCAdCdTdG-3’ (the last three bases are DNA)

5’- UUCGGGCGCCADCDTDG-3’（最后的三个碱基是DNA）。

3.根据权利要求1所述的抗艾滋病药物筛选方法，其特征在于，所述的RNA的PBS模板、DNA引物的5’末端是用[γ-³²P] ATP(3000 Ci/mmol)标记。

4.根据权利要求3所述的抗艾滋病药物筛选方法，其特征在于，所述的RNA的PBS模板、DNA引物的5’末端是用[γ-³²P] ATP(3000 Ci/mmol)标记，包括以下步骤：加入6μL2 mM的RNA模板或引物，1μL T4多核苷酸激酶，2μL[γ-³²P] ATP (3000 Ci/mmol)和1μL T4多核苷酸激酶缓冲液，37°C培养1小时，然后置于65℃灭活25分钟；加入1.1μL 3M NaCl和33.3μL乙醇于-20°C下15分钟，高速离心机（13 K）离心20分钟分离得到放射性标记的RNA或DNA，处理废液；

底部的白色小颗粒室温干燥15分钟后加入300μL水。

5.根据权利要求1所述的抗艾滋病药物筛选方法，其特征在于，以PBS互补的DNA为引物；还可以扩展以8-36　nt DNA作为引物，是指细胞tRNA₃^Lys互补序列的一部分作为引物。

6.根据权利要求1所述的抗艾滋病药物筛选方法，其特征在于，在对HIV-1反转录起始被设计在RDDP活性和RT RNase H裂解活性的药物靶点基础上，还可以15-40 nt PBS的HIV RNA基因组PBS作为模板，8-36　nt DNA作为引物，通过抑制DNA聚合酶，促进RNase　H酶靶向HIV逆转录酶药物筛选。

7.根据权利要求6所述的抗艾滋病药物筛选方法，其特征在于，对抗艾滋病药物的筛选过程中，还包括进行DNA聚合酶活性的测定、RNase H活性的测定、DNA聚合酶的筛选模型和优化RT浓度和RNase H活性的反应时间筛选系统：

（1）DNA聚合酶活性的测定

为测量RT抑制DNA聚合酶活性，采用采用21 ntRNA模板和5’-放射性标记的11nt DNA引物进行筛选；

（a）制备10μL RNA混合液：400 nM的RNA模板，200 nM 5’-放射性标记的DNA引物，使终浓度缓冲液中含有50 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃），100 nM KCl，1 mM EDTA, 1 mM二硫苏糖醇，8 mM MgCl₂；

（b）混合液70℃变性10分钟，缓慢冷却后加入1 μL 核苷三磷酸dNTPs（1 mM）；

（c） 加入不同浓度的抑制剂、药物和RT（0.2 U 到1U）（EMD Chemical, Inc.），于37℃下培养30分钟至180分钟；

（d）加入10μl缓冲液（10nM EDTA，pH 8，90%甲酰胺（V/V），和0.1%考马斯亮蓝和溴酚蓝）终止反转录；

（e）灭活的7 M尿素、15%（V/V）聚丙烯酰胺和1×TBE缓冲液在1000 V条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳1小时；

结果采用 Storm 840进行分析；

（2）RNase H活性的测定

为了测量RNase H RT的活性，选择5-放射性标记的21 nt RNA模板和11nt DNA引物；

（a）10μL反应体系测定RNA / DNA杂交双链基板（200 nm）；

终浓度缓冲液中含有50 mM Tris-HCl（p H 8.0,25℃），100nM KCl，1 mM EDTA, 1 mM二硫苏糖醇，8 mM MgCl₂；

（b）70℃变性10分钟，缓慢冷却后加入1μL 核苷三磷酸dNTPs（1μM）；

（c）加入不同浓度的抑制剂、参考药物和HIV-1逆转录酶（0.1U 到1U），37℃培养30分钟至120分钟；

（d）加入2×10μl缓冲液（10nM EDTA，pH 8，90%甲酰胺（V／V），和0.1%的二甲苯胺和溴酚蓝）终止反转录；

（e）灭活的7 M尿素、15%（V／V）聚丙烯酰胺和1×TBE缓冲液在1000 V条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳1小时；

结果采用 Storm 840进行分析；

（3）DNA聚合酶的筛选模型

用不同浓度的模板/引物，RT和反应时间，最好的RRDD 活性筛选模型如下：

11ntDNA引物： 5’-[γ-^32P] ATP-TTCGGGCGCCA-3’

21nt HIV RNA模板：3’-ACAAGCCCGCGGUGACGAUCU-5’

（a）10μL RNA混合液：400 nM的RNA模板，200 nM 5’-放射性标记的DNA引物，终浓度缓冲液中含有50 mM Tris-HCl（p H 8，25℃），100nM KCl，1 mM EDTA，1 mM二硫苏糖醇和8 mM MgCl₂；

（b）70℃变性10分钟，缓慢冷却，加入1μ L 核苷三磷酸dNTPs（1mm）；

（c）加入HIV-1逆转录酶（1 U）37℃灭活60分钟；

（4）优化RT浓度和RNase H活性的反应时间筛选系统

在0.1U RT 10分钟，30分钟，60分钟中的百分产率分别为1.9，3.2，5.9；在0.2U RT HIV逆转录酶10分钟，30分钟，60分钟中的百分产率是4.1，6.8，8.2；在0.5U的HIV逆转录酶10分钟，30分钟，60分钟中的百分比率分别是20.5，73.6，85.8；

最好的RNaseH活性筛选系统是0.5U RT和10min反应时间。