[发明专利]控制小麦千粒重的主效基因TaTGW‑7A及其CAPS标记方法

权利要求书

1.控制小麦千粒重的主效基因TaTGW-7A的CAPS标记方法，其特征在于，品种为京411，其序列如SEQ ID NO:1，其CDS区是SEQ ID NO:2；

小麦千粒重的主效基因TaTGW-7A的CAPS标记方法，步骤包括：

(1)小麦基因组DNA提取；

(2)对基因组DNA用限制性内切酶HaeIII进行酶切，对得到的酶切片段用Klenow Fragment和dATP在37℃下进行3′端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，PCR扩增引物：

F AATGATACGGCGACCACCGA

R CAAGCAGAAGACGGCATACG

文库质检合格后用IlluminaHiSeqTM2500进行测序；

(3)设计引物：

TaTGW-7A基因全长引物：

Q29：Q29F：GCAAGCCCGTCAACATGTACTAC

Q29R：AATTTCTGGACTTATGGGGAGCC

Q35：Q35F：TCTACCACGCAGCAAATCGCC

Q35R：CTGGACTTATGGGGAGCCTCT

Q37：Q37F：GCCCGTCAACATGTACTACTC

Q37R：GGTAGAGCTTCTCATAGCTGC

拼接引物：

29P：29PF：AAGGTTTGGGGAGTAAAGTTTT

29PR：AGTCAGAATTGTGCCTAAGTGC

31P：31PF：GAGGGGTAGGATGAAGGAAGA

31PR：ATTTCTGGACTTATGGGGAGC

mRNA序列：

SR；SRF：ACCCATCCCTCCATCCGTCG

SRR：ATCCGCCCACCTGGTAAAGC

酶切引物：

MQ：MQF：GCTACATACACGCACCAACCC

MQR：GACGAGAAGATAGGCGGACAG；

引物Q29、Q35、Q37用于扩增TaTGW-7A基因全长，PCR产物直接测序；引物29P和31P分别扩增TaTGW-7A基因上游和下游，PCR产物克隆测序，并拼接基因全长；引物SR用于扩增mRNA，产物克隆测序；引物MQ用于CAPS标记开发，用BsmAI在55℃下酶切2h，产物在2％的琼脂糖凝胶电泳上分离，染色后在紫外光下观察记带。

2.根据权利要求1所述的小麦千粒重的主效基因TaTGW-7A的CAPS标记方法，其特征在于，步骤(1)中小麦基因组DNA提取的步骤包括：

1)将小麦单籽粒磨碎，取0.1g加入0.7mLSDS提取液在60℃恒温下裂解45min，其间多次震荡；

2)在4℃12000rpm条件下，离心10min；

3)取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)上下颠倒旋转至两相不很快分层，所述等体积的酚：氯仿：异戊醇比例为25:24:1；

4)在4℃12000rpm条件下，离心10min；

5)取上清液加入等体积的酚：氯仿：异戊醇上下颠倒旋转数次，所述等体积的酚：氯仿：异戊醇比例为25:24:1；

6)在4℃12000rpm条件下，离心10min；

7)取上清液加入等体积的异丙醇于-20℃冰箱静置30min；

8)在4℃12000rpm条件下，离心10min；

9)用70％的乙醇洗涤两次；

10)在4℃12000rpm条件下，离心10min；

11)沉淀自然风干，4℃存，备用。

3.根据权利要求1所述的小麦千粒重的主效基因TaTGW-7A的CAPS标记方法，其特征在于，步骤(2)中选用拟南芥作为对照进行测序。

4.根据权利要求1所述的小麦千粒重的主效基因TaTGW-7A的CAPS标记方法，其特征在于，步骤(3)中CAPS标记的PCR反应体系：1μL 2.5mM dNTP,0.25μL 10uM引物，1μL 10*La Tap Buffer,0.5U TaKaRa LaTap,100ng DNA模板，用双蒸馏水补齐到10uL。