[发明专利]一种与肝癌术后肿瘤复发相关的基因及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因的检测方法，更具体的是涉及一种变异基因的检测方法，属于分子生物学领域。

背景技术

我国肝细胞癌(Hepatocellular Careinoma，HCC，简称肝癌)的发生率位居全球第一。据统计，全球每年肝癌发病人数约70万人,中国占55％，死亡率占全球45％。现已发现乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)与肝癌发病密切相关，尤其在我国约有80％以上的肝癌与乙肝病毒感染有关。由于我国乙肝相关性肝癌患者就诊时多属中晚期，且多数伴有肝硬化，手术切除率不足30％，术后复发率高达70％。肝移植术具有彻底切除肿瘤的同时又治愈乙肝肝硬化的特点，已成为乙肝相关性肝癌患者唯一的有效治疗手段。但是肝癌肝移植术后肿瘤的复发转移，导致肝移植受者预后较差，当前尚无有效根治肝癌复发的方法。术后肿瘤的复发转移极大制约了肝移植治疗肝癌的疗效，造成了肝源浪费。临床研究显示肿瘤大小、数目等常见的临床病理特征尚无法精确预测术后肿瘤复发转移。如何降低乙肝相关性肝癌肝移植术后肿瘤的复发转移已成为我国肝移植临床上亟待解决的难题。

目前乙肝相关性肝癌肝移植术后肿瘤复发的机制尚不清楚，特别是在肝癌肝移植术后复发机制中起关键作用的基因变化还不明确。因此，揭示乙肝相关性肝癌肝移植术后肿瘤复发的关键突变基因，对肝癌肝移植术后复发机制的研究，解决乙肝相关性肝癌肝移植后肿瘤复发高危人群的术前筛查、复发预测以及预防复发的个体化靶向治疗的肝移植临床难题具有重大的意义。

发明内容

基于上述发明目的，发明人首先发现了一种与乙肝相关性肝癌肝移植术后肿瘤复发高度相关的，位于人染色体18上的基因MPPE1第chr18_11897016位点的C/T点突变与乙肝相关性肝癌肝移植术后肿瘤复发高度相关，进而提供了一种用于非诊断目的的MPPE1基因点突变的检测方法，所述方法包括鉴定MPPE1基因chr18_11897016位点是否发生了C/T点突变。所述chr18_11897016位点是指位于人染色体的第11897016位点。

目前已有多种方法可用于单核苷酸构象多态性(SNP)检测，传统的方法是采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、单链构象多态性(SSCP)、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)等。新的高通量测定SNP的方法有芯片技术、变性高效液相色谱(DHPLC)、动态等位基因特异的杂交、基质辅助激光解析/电离-飞行时间质朴(MALDI-TOFMS)技术等。对于上述检测C/T点突变而言，可以使用本领域各种SNP检测的常规技术手段进行。

在一个优选的技术方案中，所述方法包括：

(1)提取待测样本的DNA；

(2)以步骤(1)获取的DNA为模板进行PCR扩增；

(3)鉴定扩增产物在chr18_11897016位点是否发生了所述C/T点突变。

所谓C/T点突变，即该位点的核苷酸序列由野生型C突变为T。

优选地，步骤(1)所述待测样本为血液、体液或组织样本。

在一个优选的技术方案中，步骤(3)的鉴定采用Sanger测序法。

优选地，所述PCR的引物序列分别为SEQ ID NO:1和2所示，扩增片段的序列为SEQ ID NO:3所示，所述C/T点突变位于所述SEQ ID NO:3的第166位碱基位点。

在一个优选的技术方案中，所述方法为PCR-MassArray质谱法。所述方法包括以下步骤：

(1)PCR扩增；

(2)SAP酶处理程序；

(3)延伸引物单碱基延伸反应；

(4)纯化；

(5)芯片点样；

(6)质谱检测和分析。

在一个优选的技术方案中，上述方法所述步骤(1)的PCR扩增的引物序列分别为SEQ ID NO:4和5所示，所述步骤(3)的延伸引物单碱基延伸反应的引物序列由SEQ ID NO:6所示，扩增片段的序列为SEQ ID NO:7所示，所述C/T点突变位于所述SEQ ID NO:7的第49位碱基位点。

本发明还提供了一种检测MPPE1基因第chr18_11897016位点点突变的PCR试剂盒，所述试剂盒含有PCR反应缓冲液、dNTP、Taq聚合酶，以SEQ ID NO:1和2所示的上下游引物。