[发明专利]EGFR基因突变检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒采用新型位点特异性扩增引物选择性放大EGFR基因突变DNA，新型封闭探针封阻野生型EGFR基因模板，从而进一步提高突变模板选择性放大的特异性。

2.按权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含有引物探针的混合液，包含用于EGFR基因突变位点20条特异性扩增的引物、5条野生序列的高效封阻探针和4条EGFR基因特异性TaqMan荧光探针。

3.按权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的20条特异性扩增的引物为16条上游特异性扩增的引物和4条下游通用引物，

①所述的16条上游特异性扩增的引物序列为：

②所述的下游通用引物序列为：

其中，18R：与Ex18F1～Ex18F3配对，19R与Ex19F1～Ex19F6配对，20R与Ex20F1～Ex20F5配对，21R与Ex21F1～Ex21F2配对；

③所述上游突变引物特征是3’末端为突变碱基，引物的Tm值在45℃～58℃，低于PCR反应复性温度3℃～10℃，以提高突变检测的特异性；所述的下游通用引物为EGFR基因第12、13密码子下游50～500碱基对范围内的一段序列，以及EGFR基因第61密码子下游50～500碱基对范围内的一段序列，该序列对突变没有选择性，可扩增所有的EGFR基因。

4.按权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：

①所述的5条野生序列的高效封阻探针的序列为：

②所述的封阻探针与EGFR基因第18、19、20、21外显子突变热点野生型序列互补，其5’端锁核酸修饰，提高封阻探针的对Taq DNA聚合酶5’端外切酶活性的耐受能力；3’端磷酸基团修饰，阻断其3’端延伸功能；突变位点至少1-2个碱基LNA修饰，提高封阻探针的单碱基识别能力，前面有+的碱基为锁核酸碱基。

5.按权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的4条特异性TaqMan荧光探针的序列为：

其中，3’端标记荧光淬灭基团，所述的4条探针分别针对EGFR基因第18、19、20、21这4个外显子。

6.按权利要求1-5中任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的引物探针的组合为以下7种组合中任一种：

组合1：

组合2：

组合3：

组合4：

组合5：

组合6：

组合7：

7.按权利要求书2所述的试剂盒，其特征在于所述的引物探针混合液浓度为1～5μM，探针浓度为0.5～3μM。

8.按权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包含有：

(i)所述的2×PCR反应液每10μL含：0.25～1U DNA聚合酶，150～300μM dATP，150～300μM dCTP，150～300μM dGTP，150～300μM dTTP，150～300μM dUTP，0.25～2U UNG酶，1～4mMMgCl₂等。优选的：0.5U DNA聚合酶，150μM dATP，150μM dCTP，150μM dGTP，100μM dTTP，50μM dUTP，0.5U UNG酶，2mM MgCl₂；

(ii)所述阳性参比品为EGFR突变阳性序列，可以为纯化PCR产物或者嵌入EGFR基因的人工质粒；

(iii)阴性参比品为EGFR野生型序列，可以为纯化PCR产物或者嵌入EGFR基因的人工质粒。

9.按权利要求1或2所述的试剂盒的应用，其特征在于

①可检出低至5～10拷贝的突变；

②可检测低至0.01％～0.1％的突变；

③新鲜组织标本的检测率达57.5％，非小细胞肺癌的检测率达60％，高于DNA测序。

10.按权利要求9所述的应用，其特征在于所提供的试剂盒能检测出EGFR基因发生在第18、19、20和21号密码子的29种基因突变，具体是：