[发明专利]一种用于对虾细胞的逆转录病毒基因转移系统

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种用于对虾细胞的逆转录病毒基因转移系统。

背景技术

逆转录病毒基因转移系统是利用逆转录病毒的侵染、复制、整合和包装相关元件，将外源基因高效导入并整合到靶细胞基因组中，因此，该系统一般由独立的可携带靶基因的病毒载体、包装细胞、包装载体(含衣壳蛋白gag、逆转录酶和整合酶pol)和囊膜蛋白载体(env或VSV-G)组成。病毒载体含有包装信号ψ、逆转录病毒长末端重复序列(LTR)启动子和多克隆酶切位点，负责携带外源基因。包装细胞不含有包装信号ψ，只负责病毒的包装。只有将逆转录病毒载体、包装载体(gag和pol)以及囊膜蛋白载体质粒共转染包装细胞后，逆转录病毒载体才能在包装细胞内被包装成具有感染能力的病毒粒子，二者功能互补，缺一不可。该系统的缺点是只能感染分裂活跃的细胞。

成熟的逆转录病毒粒子均具有囊膜，囊膜上的囊膜蛋白(envelope，env)决定病毒侵染的宿主专一性。病毒依靠其囊膜蛋白识别并结合宿主细胞膜上的蛋白受体，并通过受体介导的内吞作用，跨越质膜而侵染进入细胞质中。单嗜性env只能侵染鼠类细胞，双嗜性env则可以同时侵染鼠和人类细胞。后来，人们发现，将水泡性口炎病毒(VSV)和鼠白血病病毒(MMLV)同时感染鼠细胞时，可形成带有VSV-G囊膜蛋白的MMLV逆转录病毒成熟粒子，即假型包装病毒：含有一种病毒的核酸和衣壳(capsid)，另一种病毒的囊膜蛋白(Emi等，1991)。泛嗜性逆转录病毒基因转移系统就是通过采用VSV-G囊膜蛋白替代env囊膜蛋白，形成VSV-G假型逆转录病毒粒子，从而大大提高了该系统的宿主范围，可侵染哺乳动物、鱼类和贝类等多种动物细胞。

但是，已有的研究中发现，泛嗜性逆转录病毒基因表达系统在对虾细胞中的侵染性很差，将病毒报告质粒pMCs-GFP所包装病毒感染原代培养对虾类淋巴组织(又称Oka器官)细胞后，观察不到绿色荧光的表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于对虾细胞的逆转录病毒基因转移系统，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种在对虾细胞中有效表达的病毒表达载体，该载体中在病毒LTR启动子之后插有一段核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO:1子，以保证外源基因在对虾细胞中的有效表达。

本发明另一个方面提供一种用于对虾细胞的逆转录病毒基因转移系统，该系统的为携带有pVSV-G、pVP19和pVP28三个基因的上述病毒表达载体，因而所包装形成的病毒粒子的囊膜中，不仅含有哺乳动物来源的囊膜蛋白VSV-G，还含有对虾白斑病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的两种囊膜蛋白VP19和VP28。囊膜蛋白VP19和VP28的引入，明显提高了该基因转移系统的嗜对虾细胞性。

其中，囊膜蛋白VSV-G、VP19和VP28的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:2-4。

为了获得更好的效果，本发明对启动子(SEQ ID NO:1)的序列进行了改造，改造后的序列为SEQ ID NO:5。

本发明还提供一种使外源基因在对虾细胞中表达的方法，是将外源基因通过上述的转移系统转入对虾细胞中。

本发明具有以下优点：(1)相对于市场上已有的逆转录病毒基因转移系统，本系统的对虾细胞侵染能力得到明显提高，能够有效介导外源基因导入到对虾细胞中。(2)本系统能够克服体外培养对虾细胞难转染的问题，外源基因可在对虾细胞中得到有效表达。

附图说明

图1：本发明中克隆vp19和vp28开放阅读框的电泳结果以及pcDNA-VP19和pcDNA-VP28的质粒图谱；其中，M为DNA分子量2000Marker，A为vp19的扩增产物，B为vp28的扩增产物；

图2：日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)基因5’侧翼的启动区序列(Mj-TCTP Promoter)及其可能的转录因子结合位点；

图3：五种逆转录病毒表达载体的质粒图谱：pMCs-GFP、pMCs-eGFP、pMCs-P_Mj-TCTP-GFP、pMCs-P_Mj-TCTP-eGFP和pMCs-P_Mj-muTCTP-GFP。