[发明专利]一种与柑橘果实贮藏寿命相关的分子标记引物及应用

说明书

技术领域

本发明涉及柑橘贮藏及分子生物学领域，具体涉及一种与柑橘果实贮藏寿命相关的分子标记引物及应用。

背景技术

柑橘在世界范围内广泛栽培，已经成为全球第一大水果。柑橘产量高并且成熟期相对集中，为保证市场供应的平衡，柑橘果实采后贮藏就显得十分重要。然而，柑橘贮藏期间因环境和病害的影响导致大量果实在出售前就已经失去商品价值，导致大量经济损失。若能够开发表征柑橘贮藏寿命的生物标记，就能够对果实在贮藏期间的生理状态进行监测，让果实在其风味最佳时期上市，不仅可以减少经济损失，又可以使消费者尝到鲜美的果实。

生物标记指一个可以预测一些生物状态或是生物条件的特定指标，如血液中的小分子。目前，关于生物标记的研究在医学、细胞生物学、地质和天体生物学中广泛应用，特别是在医学研究中的癌症诊断和治疗方面。例如，在临床医学中，生物标记被细分为筛选标记、诊断标记、预诊标记、预测标记和监控标记，他们分别用于分析癌症的不同阶段(Fan Zhang and Jake Y.Chen，2013,Data Mining Methods in Omics-Based Biomarker Discovery)。在植物的研究中，生物标记更多的是应用于植物采前发育阶段的研究(Juanjuan Zhang 2010,Agudelo-Romero,Erban et al.2013)或是比较生物逆境和非生物逆境对生物造成的不同影响(Ramakrishna 2014)。目前还没有在植物果实采后贮藏阶段运用生物标记对果实的生理状态进行预测和鉴定的研究。

柑橘果实采收以后脱离了树体，形成了相对独立的代谢个体。由于能量库源关系的改变，会发生一系列的生理生化变化，特别是对果实采后品质和风味影响较大的糖酸、酚类、萜类物质。但果实在逐渐衰老的过程中，对果实的风味起主要作用的柠檬酸和葡萄糖等物质的变化呈现出一种波动趋势(Xiaohua Sun 2013)，因此这些物质并不能明显区分柑橘果实在采后贮藏过程中的生理状态，也无法用主要有机酸和糖类作为预测柑橘果实贮藏寿命的生物标记。然而，运用传统的基因表达分析手段，无法快速的大规模的检测其他微量物质的变化。

随着基因芯片技术和二代测序技术的发展，柑橘基因组草图已经完成(Xu,Chen et al.2013)，使得在全基因组水平上检测柑橘在采收贮藏过程中的基因的表达趋势变化成为可能。本发明运用时间序列的芯片数据经过分类处理可以在全基因组水平将柑橘采后贮藏过程分为三个生理阶段，并筛选出能够表征这三个不同生理阶段的一个生物标记。

发明内容

本发明是通过对温州蜜柑采后贮藏0-50d过程中基因中芯片数据的分析，筛选出能够预测柑橘果实贮藏寿命的生物标记谷胱甘肽S-转移酶(Cit.15371.1.S1_at)，在此基因序列的基础上提供了一种基于谷胱甘肽S-转移酶基因序列的qRT-PCR的引物：CGGGATGGATGCCAACAA；GCCTGGCCTTTTCCCATAAT。

本发明的另一个目的在于提供了基于谷胱甘肽S-转移酶基因序列的qRT-PCR的引物在预测柑橘贮藏寿命中的应用，特别适用于预测温州蜜柑贮藏寿命。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

本发明运用R软件mixOmics包对温州蜜柑采后贮藏0-50d的基因芯片数据进行主成分分析(PCA)和最小二乘法判别分析(PLS-DA)，获得了谷胱甘肽S-转移酶基因与柑橘的贮藏寿命相关。

因此根据谷胱甘肽S-转移酶基因设计相关的qRT-PCR引物，可根据谷胱甘肽S-转移酶基因的表达量判断某一批柑橘果实的贮藏寿命。

具体的，本发明涉及的引物及判定方式如下：

基于谷胱甘肽S-转移酶基因设计qRT-PCR的引物：CGGGATGGATGCCAACAA；GCCTGGCCTTTTCCCATAAT；进行qRT-PCR反应，可判断柑橘的贮藏寿命。

本发明特别对温州蜜柑进行了检测，结果显示：

在采后贮藏初期谷胱甘肽S-转移酶基因表达量范围在0.8-1.0,风味最佳期谷胱甘肽S-转移酶基因表达量范围在0.7-0.8，采后贮藏末期表达量低于0.7。