[发明专利]一种麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的PCR试剂盒，尤其涉及一种麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，反转录酶-聚合酶链锁反应）试剂盒。

背景技术

麻疹病毒（Measles Virus，MV），属副黏病毒科，为球形或丝形，直径约120nm～250nm，核心为单负链RNA，不分节段，基因组全长约16kb，基因组有N、P、M、F、H、L六个基因。麻疹病毒是麻疹的病原体，是儿童常见的一种急性传染病，其传染性很强，以皮丘疹、发热及呼吸道症状为特征。我国自60年代初应用减毒活疫苗以来，儿童的发病率显著下降。但在发展中国家仍是儿童死亡的一个主要原因。在天花灭绝后，WHO已将麻疹列为计划消灭的传染病之一。另外，由于发现亚急性硬化性全脑炎（subacute sclerosing panencephalitits，SSPE）与麻疹病毒有关。

此前，麻疹病毒的诊断方法主要有病毒的分离培养和抗原抗体检测。病毒的分离培养，取患者发病早期的血液、咽洗液或咽拭子经抗生素处理后，接种于人胚肾、猴肾或人羊膜细胞中培养。病毒增殖缓慢，经7～10d可出现典型CPE，即有多核巨细胞、胞内和核内有嗜酸性包涵体，再以免疫荧光技术确认接种培养物中的麻疹病毒抗原。抗原抗体检测，取患者急性期和恢复期双份血清，常进行HI试验，检测特异性抗体，也可采用CF试验或中和试验。当抗体滴度增高4倍以上即可辅助临床诊断。除此之外，也可用间接荧光抗体法或ELISA检测IgM抗体。上述两种方法对麻疹病毒的检测在一定程度上是有效地，但是它们也有不足的地方，如病毒的分离培养，是需要耗费大量人力、物力和时间的，抗体检测对一些临床样本缺乏足够的灵敏度，有时不能判定出一些正常个体中麻疹病毒的潜伏感染。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒。

本发明的目的是这样实现的：

1、麻疹病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒（简称试剂盒）

本试剂盒是在对麻疹病毒核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，利用实时荧光定量RT-PCR技术对麻疹病毒进行检测。此技术不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。

在按下述方法设计的引物和探针存在下，在荧光定量PCR仪中，对病毒核酸进行PCR扩增，来实现对麻疹病毒的检测。

具体地说，本试剂盒包括麻疹病毒的一对特异性引物（F和R）、一条特异性荧光探针（FP）、阳性对照、阴性对照、一步5×RT-PCR Buffer和Enzyme Mix；

①麻疹病毒的一对特异性引物（F和R）

依据麻疹病毒N基因序列设计特异性引物：

F：5'- CGAGCCTGGAAACTACTAATCAT-3'     

R：5'- GCCCTGAACAGCCAATATCATCT-3'

②麻疹病毒的一条特异性荧光探针（FP）

依据病毒N基因序列设计特异性探针：

FP: FAM-ATTGAGGCAATCAGACAAGCAGGGCA-MGB

    ③阳性对照

麻疹病毒标准品；

④阴性对照

RNase Free H₂O；

⑤一步5×RT-PCR Buffer配制：

Tris·Cl           20mM

    KCl                80mM

（NH₄）₂SO₄                   80mM

DTT                 1.5mM

MgCl₂              12mM

dNTP               10mM

配置混合后于冰箱-20℃保存；

⑥Enzyme Mix配制：

    Tris·Cl           20mM

    KCl                80mM

DTT                 1mM

EDTA                0.1mM

Nonidet P-40        0.5％