[发明专利]一种肠道病毒多重RT-PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的PCR试剂盒，尤其涉及一种肠道病毒多重RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，反转录酶-聚合酶链锁反应）试剂盒。

背景技术

  手足口病(Hand，foot and mouth disease, HFMD)是由肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症，个别重症患儿如果病情发展快，导致死亡。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，以及肠道病毒71型均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A 16型（Cox A16）和肠道病毒71型（EV 71）最为常见。 

    我国自1981年在上海始见本病，往后湖北、广东等十几个省市均有报道手足口病例的报道。1983年天津发生CoxA16引起的手足口病暴发流行，5～10月间发生了7000余病例，经过2年散发流行后，1986年又出现暴发，在托儿所和幼儿园2次暴发的发病率分别达2.3％和1.9％。1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出EV 71病毒，1998年EV 71感染在我国台湾省引发大量手足口病和疱疹性咽峡炎，在6月和10月两波流行中，共监测到129 106病例，重症病人405例，死亡78例，大多为5岁以下的儿童，并发症包括脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血。近几年，在大陆内地以及亚洲一些其他国家地区，如越南、马来西亚等国家，手足口病又一次大爆发，保守估计有病例几万余例，死亡率达到几百甚至上千例，所以此时迫切的需要一种快速准确的检测方法来检测肠道病毒，以助于流行病学调查和医院系统对儿童病情的快速诊治。

直到最近，从儿童咽拭子和排泄物样品中分离肠道病毒，再利用特异性的抗原检测方法来对分离的病毒进行血清型的鉴定是现今对肠道病毒的一种主要诊断方法。如今，PCR技术日渐成熟，足可以代替以前鉴定肠道病毒的检测方法，如多重RT-PCR技术，能及时迅速准确检测出多种肠道病毒，如EV71和CA16等，在大量临床样本检测中拥有快速准确高效的特性，具有巨大的市场潜能。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种肠道病毒多重RT-PCR试剂盒。

本发明的目的是这样实现的：

肠道病毒多重RT-PCR试剂盒（简称试剂盒）

本试剂盒是在对肠道病毒核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性引物，利用PCR技术对肠道病毒进行检测。此技术不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。

在按下述方法设计的引物存在下，在PCR仪中，对病毒核酸进行PCR扩增，来实现对肠道病毒的检测。

具体地说，本试剂盒包括M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、5xRT-PCR Buffer、阳性对照、阴性对照、随机引物、三对特异性引物、多重10xPCR Buffer、Taq酶；

①    依据肠道病毒基因保守序列5’端非编码区设计通用引物：

F1：5’-ACAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’     22bp，

    F2：5’-GATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’      21bp；

    依据EV71病毒VP1基因保守序列设计引物：

    EV71F：5’-AGARAGYTCTATAGGRGAYAG-3’   21bp，

    EV71R：5’-GGAGGGAGRTCTATCTCYCC-3’    20bp；

    依据CA16病毒VP1基因保守序列设计引物：

    CA16F：5’-AAGGGTAATGGARTGTGGTGAY-3’  22bp，

    CA16R：5’-GTGTGTGTTGAACCATCACTC-3’   21bp；

    其中：R=A或G，Y=C或T；

②    阳性对照：

连接有设计肠道病毒、EV71、CA16引物的基因保守序列的pGBKT-7克隆载体；

③阴性对照：

RNase Free H₂O；

④5×RT-PCR Buffer配制：

    Tris-HCl             250mM