[发明专利]一种利用细菌表面展示系统筛选单链抗体的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种利用细菌表面展示系统筛选单链抗体的方法。

背景技术

细菌展示技术又称以细胞内膜为基础的细胞间质表达技术(anchored periplasma expression technology，APEx)。该技术特点是利用细胞间质膜脂蛋白的信号肽NlpA leader将目的蛋白运送到细菌间质腔，而NlpA leader在蛋白质跨膜运输过程中被逐步降解，剩下的6个氨基酸(CDQSSS)与细胞内膜外侧的磷脂层形成脂苷键，从而将与其融合的抗体片段展示于细菌内膜外侧。当细菌外膜被溶菌酶消化后成原生质球，孵育液中的抗原可进入细菌间质与锚定在细胞内膜外侧的抗体片段结合，然后将其与荧光标记的抗体进行共孵育，阳性克隆可被流式细胞仪高通量的检测分离。

pelB leader为果胶酶基因前导肽，可以引导与其融合的蛋白质进入细菌间质，并且在进入间质后也被降解完全。其融合的蛋白质在间质腔中和牟定的具有结合能力的抗体片段结合。

细菌展示技术在筛选抗体方面具有很多优势如：(l)高富集比；(2)高阳性率；(3)由于反应在溶液状态下进行，可克服常规生物淘洗过程中由于筛选配基固定化而导致的“亲和效应”。应用流式细胞术(FCM)进行筛选可以真正的做到实时监测同步跟进，非常直观的追踪抗原表位的甄别情况。此外，该技术相对简便易行，只要经过相应的酶切位点就可以直接将抗体片段插入到展示载体中，并且经过细菌电转化可获得库容量高达10⁹～10¹⁰的抗体库，满足了抗体筛选对库容量要求。

全世界范围内，只有美国Texas大学于2007年在美国科学院院报上报道了展示Fab抗体库的展示技术APEx 2-hybrid，所利用的宿主菌为E.coli DH10B，但是迄今为止尚无文献验证该方法的可行性和实用性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种获得特异于靶标抗原的目标单链抗体的编码基因的方法。

本发明所提供的获得特异于靶标抗原的目标单链抗体的编码基因的方法，具体可包括如下步骤：

A)按照包括如下步骤的方法构建由不同待检测单链抗体编码基因组成的基因编码库：

(a1)根据已知的抗体框架区序列，设计并合成用于扩增抗体重链可变区的简并引物对1，以及用于扩增抗体轻链可变区的简并引物对2；

所述已知的抗体框架区序列为源自于携带所述靶标抗原的微生物的宿主的抗体框架区序列；如所述靶标抗原为能够感染人的乙肝病毒的某一蛋白，则所述已知的抗体框架区序列为人的抗体框架区序列；

(a2)采用所述简并引物1和所述简并引物对2从初始样本中分别扩增得到抗体重链可变区集合和抗体轻链可变区集合；

所述初始样本中含有由不同种抗所述靶标抗原的抗体组成的抗体库；

所述初始样本可为如下a)或b)：

a)健康个体的组织样本(如血液等)，所述健康个体为免疫了含有所述靶标抗原或其编码核酸的疫苗后，激起免疫反应产生相应抗体的健康个体；

b)患病个体的组织样品(如血液等)，所述患病个体为因携带所述靶标抗原的致病微生物(如病毒、细菌或真菌等)感染所引起的患病个体，且经证实已激起免疫反应并产生抗体。

所述抗体重链可变区集合为由不同重链可变区组成的集合；所述轻链可变区集合为由不同轻链可变区组成的集合；

所述简并引物对1和所述简并引物对2均既可为一个引物对，也可为多个引物对。当为多个引物对时，采用所述简并引物对1中的每个引物对分别对所述初始样本进行扩增，扩增所得片段的集合即为所述抗体重链可变区集合；采用所述简并引物对2中的每个引物对分别对所述初始样本进行扩增，扩增所得片段的集合即为所述抗体轻链可变区集合。

(a3)将所述抗体重链可变区集合中的不同重链可变区和所述抗体轻链可变区集合中的不同轻链可变区通过重链恒定区CH1进行随机连接，获得由不同待检测单链抗体编码基因组成的基因编码库；

所述重链恒定区CH1为源自于携带所述靶标抗原的微生物的宿主的重链恒定区CH1的前15个氨基酸；如所述靶标抗原为能够感染人的乙肝病毒的某一蛋白，则所述重链恒定区CH1为人的重链恒定区CH1的前15个氨基酸；

在本发明中，所述抗体重链可变区连接于所述重链恒定区CH1的上游；所述抗体轻链可变区连接于所述重链恒定区CH1的下游。

B)按照包括如下步骤的方法获得特异于所述靶标抗原的所述目标单链抗体的基因编码序列：