[发明专利]用于急性早幼粒细胞白血病荧光检测的纳米探针及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于急性早幼粒细胞白血病荧光检测的纳米探针及其制备方法。

背景技术

急性早幼粒细胞白血病(APL)是急性髓细胞白血病的一种特殊类型，约占成人急性髓细胞白血病的10%，绝大多数的APL患者存在典型的t(15;17)(q22;q21)染色体异位，阳性率约占98%，维A酸受体α基因(RARα)与15号染色体的早幼粒细胞白血病(PML)基因形成PML-RARα融合基因，该融合基因的下游蛋白分子复合物为转录共抑制分子，通过抑制基因转录从而抑制细胞的分化与凋亡，这是APL的特异性标志和靶向治疗的重要分子基础，它不仅能够帮助APL的诊断,而且可以作为APL治疗过程中病情和疗效检测的主要指标。所以，PML/RARα融合基因的检测在APL的诊断和治疗过程中发挥着重要的作用。

PML/RARα融合基因的检测一直是细胞遗传学和分子生物学研究领域的重点和热点之一，目前常用的检测方法主要有：染色体分析、荧光原位杂交（FISH）、流式细胞术（FCM）、实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）等。尽管染色体分析法可以在结构和数量上分析单个细胞染色体的异常，但是却要花费较长的时间和精力，从而降低了检测效率。荧光原位杂交是非放射性检测体系，荧光试剂和探针经济、安全、稳定，而且灵敏度高，但是，不能达到100%杂交，特别是在应用较短的互补DNA探针时效率明显下降。虽然流式细胞术可以高速分析术上万个细胞，但是，仅限于在细胞水平上识别细胞的形貌、尺寸以及荧光性质等。RT-PCR法具有很高的灵敏度，但常常会出现假阳性和假阴性结果，此外，该方法难以定量。因此，开发高灵敏度、高选择性，背景影响小的可用于PML/RARα融合基因荧光检测的纳米探针具有重要的理论意义及现实的应用价值。

发明内容

本发明的目的之一在于针对现有技术中存在的不足，提供一种用于急性早幼粒细胞白血病荧光检测的纳米探针，从而实现对PML/RARα融合基因的检测。

本发明的目的之二在于提供该纳米探针的制备方法。

为实现上述目的，本发明所提供的技术方案是：

一种用于急性早幼粒细胞白血病荧光检测的纳米探针，其特征在于该纳米探针由能量给体和能量受体组成，所述的能量给体和能量受体通过π-π键相互作用结合在一起；所述的能量给体是一端带有氨基的探针DNA通过共价键键合的方式嫁接到表面羧基化后的具有核壳结构的上转换发光纳米晶上而形成的，所述的能量给体与能量受体的质量比为20:1~24:1；所述的能量受体为：单壁碳纳米角、氧化石墨烯或碳纳米管；所述的具有核壳结构的上转换发光纳米晶的表面羧基化率为：30%~60%；所述的探针DNA为：5’-NH₂-TCT CAA TGG CTG CCT CCC-3’；所述的带有氨基的探针DNA与所述的上转换发光纳米晶的摩尔比为：1:2000~1:2500。

上述的具有核壳结构的上转换发光纳米晶为：NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄、NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄:Yb,Er、NaYF₄:Yb,Er@NaGdF₄或NaYF₄:Yb:Er@NaGdF₄:Yb,Er。

一种制备上述的用于急性早幼粒细胞白血病荧光检测的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.通过配体交换法将具有核壳结构的上转换发光纳米晶表面修饰上羧基，得到Cit-UCNPs；将该Cit-UCNPs经N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺活化，得到活化后的Cit-UCNPs；

b. 将步骤a所得活化后的Cit-UCNPs与探针DNADNA分子按照质量比260:1~290:1的比例溶于去离子水中，4℃搅拌10~12小时；经分离提纯得到能量给体即Cit-UCNPs-ssDNA；

c .将步骤b所得能量给体与能量受体按照质量比为20:1~24:1的比例溶于去离子水中，4℃搅拌1~2小时，最终得到急性早幼粒细胞白血病荧光检测的纳米探针。

上述的步骤a的具体方法为：

(1) 将具有核壳结构的上转换发光纳米晶分散在甲苯和氯仿的混合溶剂中，其中，甲苯和氯仿的体积比为1:2~2:3；上转换发光纳米晶与混合溶剂的质量体积比为：1mg/mL~3mg/mL；