[发明专利]带鱼鱼骨铁螯合胶原肽制备方法

权利要求书

1. 带鱼鱼骨铁螯合胶原肽制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）带鱼鱼骨的预处理：将带鱼鱼骨按照料液比1g:15～20mL加入到0.1mol/L的NaOH溶液于1～4℃下浸泡2～4h，脱除非胶原蛋白；将经NaOH溶液处理后的带鱼鱼骨用蒸馏水洗涤至中性并沥干，再按照料液比1g:5mL至1g:8mL加入pH 7.4的EDTA溶液，于1～4℃下浸泡2～3天，每天更换1次EDTA溶液，蒸馏水洗涤2～3次，干燥、粉碎，得脱钙带鱼鱼骨粉；2）带鱼鱼骨胶原蛋白的制备：将脱钙带鱼鱼骨粉按照料液比1g:5～8mL加入到0.5mol/L乙酸溶液并在1～4℃下动态浸泡3d，10000g离心20～25min，取上清液，并加入NaCl至溶液终浓度为1.0mol/L，静置60～90min，12000g离心25～30min得沉淀物，冷冻干燥即为带鱼鱼骨胶原蛋白；3）带鱼鱼骨胶原蛋白的酶解：将带鱼鱼骨胶原蛋白按照料液比1g:20～25mL加入到pH 7.0、浓度0.2mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，按照胶原蛋白质量的1.5～2.0%向溶液中加入1000LAPU/g的复合风味蛋白酶，于温度45～50℃酶解4～6h后，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min后，冷却至45～50℃；按照胶原蛋白质量的1.2～1.5%向溶液中加入1.0×10⁵U/g的中性蛋白酶，于温度45～50℃下酶解4～6h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15min后，8000g离心25～30min，取上清液，即为酶解产物；4）带鱼鱼骨铁螯合胶原肽的制备：将制备的酶解产物采用1kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液依次经固定化铁离子亲和层析和反相高效液相色谱纯化，得到带鱼鱼骨铁螯合胶原肽；所述步骤1）的带鱼为带鱼Trichiurus haumela；所述步骤4）的固定化铁离子亲和层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：固定化铁离子亲和层析：将所述超滤酶解液溶于双蒸水配成浓度为10～20mg/mL的溶液，经过固定化铁离子Sepharose6B亲和层析柱吸附后，用5～8倍柱体积双蒸水洗脱除去未吸附多肽，然后用3～5倍柱体积的pH 3.0的双蒸水洗脱层析柱，收集洗脱液，冻干，得亲和层析酶解物；反相高效液相色谱纯化：将所述的亲和层析酶解物用双蒸水配成80～100μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，根据对铁离子的螯合活性得到1个高Fe螯合活性胶原肽Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Trp-Gly-Pro-His-Gly；进样量15～20μL；色谱柱是规格为250×4.6mm，5μm的ZorbaxC18色谱柱；流动相为25%乙腈；洗脱速度为1.0～1.5mL/min；紫外检测波长为214nm。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）采用的EDTA溶液的浓度为0.5mol/L。