[发明专利]一种PCR酶联双杂交法检测病原微生物检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及临床医学微生物检测、水及环境等微生物检测领域，具体涉及微生物定量、定性检测领域。

背景技术

临床医学微生物现阶段国内外检测方法主要有传统生化鉴定法、免疫学检测技术、核酸分子杂交技术、PCR技术、基因芯片技术等一些简单的分子生物学和免疫学方法。

传统的生化鉴定法需要对待测样本接种在培养基上进行分离培养，通过一系列繁琐的生理生化实验的特征、结果来甄别病原体种类，该方法虽然是微生物实验室中一种常用的、经典的鉴别方法，但其过程往往需要数天时间、耗费较大的人力物力、实验得到的表型特征可能还受到外界环境影响而出错，特别对于一些处于“活的不可培养状态”的微生物，传统的培养方法难以培养、甄别，留下重大隐患。

免疫学方法检测技术主要是采用酶联免疫分析(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,E LISA),是把抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高校催化作用有机地结合起来的一种检测技术，既可以检测抗原也可以检测抗体；既可以进行定性也可以进行定量测定。ELISA技术简繁、方便，较传统检测技术快速，但存在交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足。

聚合酶链式反应(Ploymerase Chain Reaction,PCR)是分子生物学技术的一种，用于放大DNA片段，即生物体外进行的DNA扩增。一般的PCR需要经过预变性，变性、退火、延伸的25～35次循环，可将靶DNA序列扩增近百万倍。1988年Chamberian等提出了多重P CR的概念，同一PCR反应体系里加上二对以上引物，可同时扩增出多个核酸片段，适合多种微生物的同步分析与鉴定。但也存在扩增失败或非特异性产物，以及外源性污染出现假阳性结果。

基因芯片(DNA chip)又称为DNA微阵列(DNA microassay)或DNA芯片，是生物芯片的一种，是核酸分子杂交技术发展延伸而来的。通过微加工技术，将数以万计甚至百万计的基因探针即DNA片段有规律地排列成二维DNA探针阵列，固定到硅片、玻片等固态支持物上，与标记的样品分子进行核酸杂交，用于基因检测工作。其测序原理与核酸杂交一样，但解决了传统核酸杂交技术操作繁杂、检测效率低、自动化程度不高的缺点。基因芯片技术价格昂贵，同样还有些问题有待解决，如提高芯片的特异性和检测信号的敏感性，降低芯片的制作成本等，而且多数芯片都需要昂贵的检测仪器，这些问题使得基因芯片到目前主要局限于实验室研究而未能广泛应用于临床病原微生物的检测与鉴定。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提出一种结合了PCR、DNA杂交和酶联免疫三项技术优势的多种微生物同步定性和定量检测方法。

本发明采用的技术方案：应用经亲和素包被的酶标孔板，特异性结合生物素化捕获探针，使其固定于孔板之上。PCR扩增系统包含数对特异性引物，TaqDNA聚合酶，和病人样本提取物，可以选择性扩增其含有的病原体基因片段。扩增产物一端与捕获探针杂交，另一端与酶标记的特异性探针杂交，经过清洗除去未结和的探针，经底物显色，停止反应，读取光密度，从而得知该样本是否含有相应病原微生物和其数量(见图1)。PCR酶联双杂交法本方法结合现有技术的优点，应用多联扩增PCR,Avidin-Biotin亲和固相连接，双探针杂交，保证了很高的敏感性和特异性，同时可检测多个常见病原，应用灵活，节省人力物力。

所述方法具体包括如下步骤：

1)亲和素(Avidin)包被聚苯乙烯板子的制备

链霉亲合素(Thermo)溶解在标准碳酸氢盐缓冲液(pH9.5)在室温下过夜，使其最终浓度为5mg/ml。该板包被前经UV光照射20分钟。另外，亲和素包被的板可以从生命技术公司购买。

2)样本来源

本检测应用人体标本，包括体液，如分泌物，咽拭子混悬液，脑脊液，血清等。

3)样本处理

待测样品反复冻融3次，每次都要涡旋混匀。

4)DNA模板提取和探针制备

DNA提取用从液体中纯化DNA的试剂盒。这个试剂盒适合于液体里含有核酸的提取和纯化，如：咽拭子混悬液,脑脊液，血清尿液，痰液等.按厂家推荐的操作程序操作。

5)多重PCR扩增目的片段

CMV检测

上游引物:5’-gttctcagccacaattactgag-3’

下游引物:5’-caagcggcctctgataaccaag-3’