[发明专利]一种胎盘造血干细胞的制备方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种胎盘造血干细胞的制备方法。该方法用灌洗液灌注清洗预处理后的胎盘；将动员剂从胎盘动脉灌注至胎盘静脉流出动员剂停止并结扎胎盘动静脉静置；松开胎盘动静脉并从动脉灌注与前述同量的动员剂，从静脉处收集全部液体，离心取细胞沉淀，然后依次经羟乙基淀粉法和红细胞裂解法回收纯化包含造血干细胞的单个核细胞，重悬后获得所述胎盘造血干细胞。本发明改善动员剂灌注法工艺，选择多种相互适宜的组分组成新型动员剂应用于胎盘造血干细胞制备过程中，不仅能够动员胎盘内部的造血干细胞并在短时间内迅速进入血液循环系统，而且同时提高了包含造血干细胞的单个核细胞数量及其活细胞数量以及CD34阳性细胞数量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种胎盘造血干细胞的制备方法。

背景技术

造血干细胞(Hemopoietic Stem cell，HSC)是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，它不是组织固定细胞，可存在于造血组织及血液中。造血干细胞是所有造血细胞和免疫细胞的起源，具有自我更新和多向分化能力。它的基本特性是具有自我更新能力，即经过一个细胞周期活动之后，可以产生两个与分裂前性质相同的造血干细胞，同时又具有多向分化能力，即在一定的环境条件下，造血干细胞具有向各系血细胞分化的能力。

随着对造血干细胞(HSC)日渐深入的研究，HSC移植已经成为治疗许多恶性血液系统疾病及其他肿瘤的有效手段。目前，HSC的主要来源是骨髓、外周血及脐血，骨髓和外周血HSC增殖和分化能力下降，并且易受供者健康状态影响，而脐血HSC数量有限，这些限制因素使其不能满足日渐增长的HSC临床应用需求。近年来，国内外学者研究发现，胎盘中含有大量的早期干细胞，包括数量丰富的造血干细胞。这些干细胞在胎盘中行使着造血的功能。小孩出生后剥离的胎盘内所含的造血干细胞，是脐带血的8-10倍，可供小孩自用几次，甚至可提供给多个成人患者的治疗。胎盘造血干细胞的成功分离和提取可解决临床上HSC的来源问题，具有广阔的临床应用前景。

目前，胎盘HSC的分离提取方法主要采用机械法、机械酶解法等。机械法所获取的细胞数量较少，且含有大量的细胞碎片，细胞活率低；而机械酶解法能获取数量充足的细胞，但其中的造血干细胞含量较低。此外，整个提取过程操作繁复、耗时长、成本高；提取出来的细胞活率低。

美国专利US 20120177616“Methods for augmentation collection ofplacental hematopoietic stem cells and uses thereof”公开了一种采用动员剂获取造血干细胞的方法，其将动员剂灌注至胎盘动静脉，动员胎盘组织中的造血干细胞进入到血管中，以此方式获得造血干细胞，此动员剂方法虽然较之机械法和机械酶解法在细胞数量和细胞活率方面有一定优势，但是其效果仍然不够理想，需要进一步改进制备整个制备技术。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胎盘造血干细胞的制备方法，使得所述制备方法能够提高包含造血干细胞的单个核细胞数量及其活细胞数量。

本发明的另一个发明目的在于提供一种胎盘造血干细胞的制备方法，使得所述制备方法能够提高CD34阳性细胞数量，即造血干细胞数量。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种胎盘造血干细胞的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、胎盘预处理后，用灌洗液灌注清洗胎盘；

步骤2、将动员剂从胎盘动脉灌注至胎盘静脉流出动员剂停止并结扎胎盘动静脉静置，所述动员剂为包括AMD3100、枸橼酸盐缓冲溶液、青-链霉素双抗、罂粟碱、N-乙酰半胱氨酸、维生素C和Z-VAD-FMK的DMEM高糖基础培养基；