[发明专利]培养铁皮石斛原球茎的方法

说明书

技术领域

本发明属于药用植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用间歇浸没生物反应器进行铁皮石斛类原球茎产业化扩繁的方法。

背景技术

铁皮石斛，是我国珍稀的中药材。为“中华九大仙草”之一，又称“千金草”，《神农本草经》中记载石斛“主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳赢瘦、强阴、久服厚肠胃”。现代药理学研究表明，铁皮石斛含有生物碱、多糖、丰富的微量元素等多种有效成分。铁皮石斛植株成活率低、生长速度慢、繁殖率低、产量低、价格昂贵，根本无法满足市场需求，以植物组织培养物（铁皮石斛原球茎）代替原植物是解决石斛资源紧缺最有效的途径 。

原球茎是种子萌发过程中，原胚萌动膨大，突破种皮后形成的浅黄色小圆锥形胚性组织。增殖迅速，易于规模化生产，是一种潜在的铁皮石斛药用新资源。类原球茎（protocorm like bodics, PLBs）又称拟原球茎，是铁皮石斛组培过程中产生的类似原球茎的一种特殊组织结构，是正在生长分化的体细胞胚胎，可由植株的不同部位萌发产生，类原球茎具有易分散、增殖效率高、生长周期短，可实现规模化生产的特点，并具备与原植物同样的形态发育和物质代谢潜能。

现代药理学试验表明铁皮石斛原球茎、类原球茎与原药材均具有提高免疫功能作用，且两者作用强度相似。根据《食品安全法》和《新资源食品管理办法》的规定，经新资源食品评审专家委员会审核，批准铁皮石斛原球茎为新食品资源。

近年来，也有许多关于铁皮石斛原球茎的培养方式申请了专利，例如中国专利（申请号为201010100377.6）公开了一种铁皮石斛原球茎的间歇式发酵培养，该培养方法设计简单，成本低廉，无特定的间歇浸没生物反应器。但是该无法进行通气量、浸没频率等相关条件的调控，在一定程度了不利于铁皮石斛原球茎规模化扩繁；此外，浸没频率会影响组织培养物的内部激素的分泌，从而无法实行自动化。同时其他相关专利均是以铁皮石斛原球茎分化，获得无菌苗，进行种苗培养。

上述专利文献中虽然也采用了间歇浸没的方法培养所使用的培养铁皮石斛原球茎，但是所采用的装置却不相同，由于不同间歇浸没培养装置的操作方法不同，同时由于各种植物在生理、生化上的不同，即使相同的培养方法对不同的植物培养也是不一样的，需要不同的培养条件和处理方式，并不能通过简单的有限次实验推理来得到。上述文献专利中提及的步骤以及其中涉及到的具体的培养方式和培养条件完全不能用于利用间歇浸没生物反应器培育铁皮石斛原球茎。

应用间歇浸没生物反应器进行铁皮石斛原球茎产业化培养可以弥补传统方法生产的缺陷，获得大量高质量的铁皮石斛原球茎提供了有效的方法。

鉴于利用间歇浸没式培养方法进行铁皮石斛原球茎的培养未见报道和公开应用，因此，有必要研究出一种利用间歇浸没生物反应器进行铁皮石斛原球茎产业化扩繁的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种周期短、成本低、操作简单自动化适用于产业化生产的培养铁皮石斛原球茎的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该培养铁皮石斛原球茎的方法依次包括前期准备、原球茎的萌发与增殖、生物反应器生产等步骤：

（1）前期准备：

①固体培养基配制：固体培养基的配方为1/2MS基本培养基，添加NAA 0.1~5.0 mg/L；蔗糖浓度0~50 g/L；香蕉液0~80 g/L；琼脂粉0~10 g/L，调整pH值5.0~7.0，煮沸，分装，灭菌处理后，备用；

②液体增殖培养基配制：液体增殖培养基的配方为1/2MS基本培养基，添加NAA 0.1~5.0 mg/L；6-BA 0.1~10.0 mg/L；蔗糖浓度0~50 g/L；香蕉液0~80 g/L，调整pH值5.0~7.0，培养液配制完成后，煮沸，分装，灭菌处理后，备用；

③生物反应器灭菌：将生物反应器进行组装，在组装过程中将玻璃珠放入生物反应器中，然后包扎灭菌，灭菌处理后，备用；

（2）原球茎的萌发与增殖培养：

将外植体接种于1/2 MS固体培养基中，进行原球茎的萌发与增殖，然后经过3~5次继代培养，筛选出生长快、增殖率高、无明显分化的铁皮石斛原球茎，作为生物反应器生产铁皮石斛原球茎的种子；

（3）过渡观察培养：

将步骤（2）中筛选出的优质原球茎先接种到液体增殖培养基中进行观察培养，接种密度10~70 g/L，培养时间3~5d；

（4）生物反应器培养：