[发明专利]基于芽变的苹果选种的方法

权利要求书

1.一种基于芽变的苹果选种的方法；其特征是：其步骤是：通过SSAP分子鉴定方法对发现的疑似芽变样本确定是芽变样本、还是饰变样本，对芽变样本进行芽变资源扩繁得到品种体系，对得到的品种体系进行果实质量和经济性状评价，确定芽变样本是否为新品种。

2.根据权利要求1所述的基于芽变的苹果选种的方法；其特征是：其步骤是：

初选

发掘变异：苹果园中发掘疑似芽变样本并且选好对照样本，对疑似芽变样本和对照样本进行登记编号并且作出明显区别的标记；

分析变异：通过SSAP分子鉴定方法对疑似芽变样本和对照样本进行分析，确定变异样本是芽变样本或饰变样本；

b、复选

芽变资源扩繁：把芽变样本和对照样本分别嫁接到矮化苹果砧上，再定植到选种圃中进行培育；

品系评价：对选种圃中的嫁接在矮化苹果砧上的芽变样本和对照样本的每一株进行建立档案并且分别观察，连续进行至少三年的观察记录，当嫁接在矮化苹果砧上的芽变样本和对照样本盛产果实后，至少连续三年，对果实和其它重要经济性状进行全面分析鉴定，确定芽变样本是否为最优良的品系并且定为入选品系样本，把入选品系样本在不同生态环境条件地区进行多点试验栽植，再对果实和其它重要经济性状进行全面分析鉴定；

决选

根据入选品系样本的选种历史、分析鉴定结果和发展前景；即：入选品系样本在选种圃内连续三年以上果树学与农业生物学的完整鉴定数据、在不同生态条件下的试验结果和有关鉴定意见、及结对照的新鲜果实和经审查鉴定后确定该品系在生产上有发展前途，把入选品系样本进行命名。

3.根据权利要求2所述的基于芽变的苹果选种的方法；其特征是：SSAP分子鉴定方法：

对疑似芽变样本和亲本对照样本采集嫩叶，提取基因组DNA，将基因组DNA进行酶切，然后加上酶切接头，再经过预扩增和选择性扩增，PCR 终产物由6％聚丙烯酰胺变性胶电泳分离，银染显色，根据条带有无差异，确定是否为芽变。

4.根据权利要求3所述的基于芽变的苹果选种的方法；其特征是：所述的基因组DNA提取方法如下：

一、DNA试样的制取

a、将0.1 g的疑似芽变样本和亲本对照样本采集嫩叶分别在液氮中研碎后移入1.5 mL离心管Ⅰ中；

b、在离心管Ⅰ中加入600 μL温度为65℃的CTAB后提取缓冲液； CTAB是指2% CTAB；100 mM Tris-HCl，pH 8.0；20 mM EDTA，pH 8.0；1.4 M NaCl；使用前加入0.4% β-巯基乙醇；

c、将缓冲液放到离心管Ⅱ中，把离心管Ⅱ在65℃保温箱中保温30 min，期间颠倒至少十次，再加入600 μL的v/v=24/1的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒，5 min， 在转速为10000 r/min的离心机中进行离心运动10 min；

d、把离心管Ⅱ的500 μL的上清液移入到离心管Ⅲ，在离心管Ⅲ中加入加入600 μL的v/v=24/1的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒至少十次，在转速为10000 r/min的离心机中进行离心运动10 min；

e、把离心管Ⅲ的300 μL的上清液移入到离心管Ⅳ，在离心管Ⅳ中加入二倍体积预冷的的无水乙醇，颠倒混匀；

f、把离心管Ⅳ中的沉淀物，放到含350 μL TE缓冲液的1.5 mL离心管Ⅴ中，当沉淀溶解后，在转速为10000 r/min的离心机中进行离心运动10 min；

g、把离心管Ⅴ的300 μL的上清液移入到离心管Ⅵ，在离心管Ⅵ中加入1 μL 的10 μg/μL 的RNase，轻轻混匀后在37℃水浴1 h，冷却至室温，再加入1/10体积的pH 5.2的3 M NaAc，混匀后再加入二倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀，在温度为–20℃的保温箱中静置30 min，在转速为10000 r/min的离心机中进行离心运动10 min；

h、对离心管Ⅵ中的沉淀物，进行至少两次的使用70%乙醇洗涤并且使用离心运动进行沉淀； 在超净工作台上对沉淀物进行风干，加入100 μL TE溶解沉淀物得到DNA试样；

二、DNA试样的酶切

采用EcoRI和MseI两种限制性内切酶对DNA试样进行酶切，反应体系如下：

混匀后低速离心至少十秒，进行37℃水浴4 h；

所述的连接反应，用T₄ DNA ligase 即NEB进行连接反应，反应体系如下：

充分混匀，低速离心至少十秒，16℃连接反应过夜，得到DNA酶切产物；

所述的SSAP引物包括：

三、DNA酶切的产物进行PCR扩增反应

预扩增

     利用不含有选择性碱基的EcoR I和Mse I引物进行预扩增反应，PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，24个循环；72℃ 10 min延伸；

选择性扩增

根据CTcrm1和 CTcrm2反转录转座子基因的LTR序列设计用于S-SAP分子标记的LTR Primer，与EcoR I和Mse I的选择性引物结合进行选择性扩增；

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

94℃ 5 min；94℃ 30 s，65-56℃/cycle - 0.7℃ 30 s，72℃ 1 min，12个循环；94℃ 30 s， 56℃ 30 s，72℃ 1 min，24个循环；72℃ 10 min延伸；

四、PCR产物电泳检测

a、用清洗液将制胶的两块玻璃板彻底洗净，蒸馏水冲洗，滤纸擦干，乙醇擦洗后晾干；同时将边条和梳子洗净、凉干；

b、将剥离硅烷溶液即3 mL无水乙醇+300 μL Repel均匀地涂在短板上，亲和硅烷溶液即3 mL无水乙醇+10 μL冰醋酸+10 μL Binding均匀地涂在长板上，室温放置至少20 min晾干玻璃板；将长板和短板装配好，水平仪调至水平后，预插入梳子检查梳子是否合适及插入的最佳位置； 取50 mL 6%的PA胶加入250 μL 10%过硫酸氨即APS、50 μL TEMED轻轻混匀灌入玻璃板中，灌完后，将梳子插入适当位置，将板调至水平，室温放置至少2 h，待胶凝固后用于电流；

PCR 产物变性处理：加入一半体积的上样缓冲液，95℃ 5 min后迅速放置于冰上，离心后用于测序胶电泳分析；将梳子小心拔出，清洗干净；板装到电流槽中，加入合适的电泳缓冲液，用移液器将梳子处的气泡赶出，60 W恒定功率预电泳30 min；

将梳子插入，其深度为刚进入胶面，上样电泳，直至二甲苯菁到胶的3/4处；

c、固定：电泳结束后，将玻璃板从电泳槽取下，拔出梳子，并取下长板，放入10%乙醇溶液中，轻摇7 min；

染色：在1 L蒸馏水中加入1.5 g硝酸银，1.5 mL甲醛，轻摇7 min；

显影：染色后在蒸馏水中迅速漂洗3~4 s，转入1.5%的氢氧化钠溶液中（先加入一定浓度的甲醛），显影至条带清晰；

终止：当条带清晰时，将玻璃板放入固定液中，终止2 min；

漂洗：蒸馏水漂洗10 min；在灯箱上进行观察拍照，得到电泳图。

5.根据权利要求1所述的基于芽变的苹果选种的方法；其特征是： 苹果芽变新品种即泰山嘎拉选育过程。