[发明专利]一种高分辨率SSR分子标记基因分型的方法

权利要求书

1.一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其特征在于：该方法包括设计SSR分子标记的三引物，配制SSR分子标记专用的PCR配方，进行SSR分子标记专用的PCR反应，SSR分子标记的PCR产物的分析，基因分型的数据分析步骤。

2.如权利要求1所述的一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其特征在于：

所述的设计SSR分子标记的三引物为通用荧光标记引物，带尾正向引物和反向引物，原始储备液浓度均为5uM，在PCR反应中的用量体积的比为2∶1∶4；所述通用荧光标记引物为公共引物，在引物合成时在5’末端加荧光标记，选择荧光标记物为ABI测序仪能识别的荧光试剂FAM或HEX或TAMRA，其中，荧光的选择不能与ABI测序仪基因分型所用的DNA分子参照的荧光相同；正向引物和反向引物为带有SSR序列位点的靶序列的特异引物，使用引物设计软件Primer3设计，在线使用网址为http://frodo.wi.mit.edu/primer3/，设计时引物序列不能在SSR序列中，PCR产物包含SSR位点，长度为19‐24bp，最适Tm为60℃，GC％值在45‐55％，无引物的二聚体结构；带尾正向引物为正向引物的序列的5’端加上与荧光标记引物相同的序列CGTTGTAAAACGACGGCCAGT，不加荧光标记物，然后使用软件OligoAnalyzer 3.1(http://www.idtdna.com/)检测，若无引物二聚体和发夹结构产生，该带尾正向引物序列合理，设计完成；如果有引物二聚体产生，则要用Primer3重新设计新的正向引物和荧光标记引物相同的序列以后再用软件检测，直至无引物二聚体产生。

3.如权利要求1所述的一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其特征在于：所述的配制SSR分子标记专用的PCR配方中的Taq聚合酶是全功能的DNA聚合酶，是用100ul或者更小的洁净PCR试管，PCR反应总体积为15ul，按表1的配方依次加入设计的3种引物、待测样品的DNA和去离子水，荧光引物最后加入，混合试剂，轻微漩涡混合，并离心5秒钟。这里的全功能的DNA聚合酶配方采用Hot Start Flex 2X Master Mix，但不限制于Hot Start Flex 2X Master Mix，

表1每15ulPCR反应的试剂配方

4.如权利要求1所述的一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其特征在于：所述的SSR分子标记专用的PCR反应是将步骤3混好液体的试管置于带有Touchdown功能的PCR仪器进行扩增反应，PCR反应由3个touchdown循环和后续的35个标准循环组成，PCR循环的设置为起始变性温度为94℃ 3分钟，3个touchdown循环为94℃变性30秒，68℃退火1分钟，每执行一个循环后将退火温度降低2℃，72℃延伸1分钟，35个标准循环为94℃变性30秒，58℃退火45秒，72℃延伸45秒，完成以上循环以后，在72℃保持10分钟，最后将PCR产物冷却到室温或者4℃，从PCR仪取出以后，立即包裹锡箔纸避光，冷冻保存或者继续实验。

5.如权利要求1所述的一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其特征在于：所述的SSR分子标记的PCR产物的分析分为琼脂糖凝胶电泳和测序仪基因分型，其中琼脂糖凝胶电泳步骤非必须；所述琼脂糖凝胶电泳是移取10ul的PCR产物用3％琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法电泳分离，EB染色，紫外成像仪观察PCR扩增的DNA片段；移取1‐5ul的PCR产物，用ABI3730XL按照仪器标准的基因分型法检测，DNA分子大小的内部参照标准采用LIZ500，检测前，不同荧光标记的PCR产物可以多重混合，混合至同一个PCR管进行检测，但是最多混合三种荧光标记的产物。

6.如权利要求1所述的一种高分辨率的SSR分子标记基因分型的方法，其特征在于：所述的基因分型的数据分析采用的数据文件为.fsa格式，每一个PCR孔的样品产生一个对应的数据文件.fsa；将数据导入数据文件分析软件如GeneMapper或者GeneMarker，然后按照软件的说明进行基因分型的数据分析；ABI测序仪的基因分型检测时，标准DNA分子参照的范围包涵50‐500bp；1‐5ul PCR产物的用量用于ABI测序仪的基因分型检测，剩余PCR产物能用于3％的琼脂糖凝胶电泳检测。