[发明专利]TaqMan实时荧光定量PCR检测伊丽莎白巴尔通体的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种TaqMan实时荧光定量PCR检测伊丽莎白巴尔通体的方法。

背景技术

伊丽莎白巴尔通体(Bartonella elizabethae，Be)是一种能引起巴尔通体心内膜炎疾病的革兰阴性杆菌。1993年，Daly等人从美国马州伊丽莎白医院一心内膜炎患者血液中分离出来，是巴尔通体属中新发现的人兽共患病病原菌。

伊丽莎白巴尔通体具有巴尔通体属细菌的共同特征，对培养条件要求较高、培养时间长。目前，国内外对此菌的检测方法主要是分离培养和常规PCR检测核酸分子。分离培养方法虽然能够获得直接的感染证据，但是由于Be难于培养、生长缓慢，又由于样品取材限制，培养成功率较低，不适用于快速诊断、筛查和流行病学调查。在血清学检测方法中，国际上通常应用IFA法检测巴尔通体抗体，有些种如汉赛巴尔通体(B.henselae，Bh)和五日热巴尔通体(B.quintana，Bq)有市售的检测试剂盒，对于Be仅有国外个别实验室能够进行，而且应用全菌作为检测抗原存在交叉反应，另外IFA法判读有一定的主观性，不易于推广使用和结果比较。常规PCR虽然避免了上述两类方法的缺陷，但是方法的敏感性和可能存在污染是不得不考虑的问题。荧光定量PCR方法由于其灵敏度高、自动化程度高等优点，能够很好地解决上述问题，在传染病病原检测上日渐普及，因此有必要建立荧光定量PCR方法检测伊丽莎白巴尔通体。

目前，国内外尚未见应用TaqMan探针荧光定量PCR方法检测伊丽莎白巴尔通体的报道。本研究选取伊丽莎白巴尔通体特有的一段核酸序列设计特异引物和探针，利用探针技术建立检测此菌的荧光定量PCR方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种TaqMan实时荧光定量PCR检测伊丽莎白巴尔通体的方法。

为了实现本发明目的，本发明选取伊丽莎白巴尔通体特有的基因序列为目标序列，设计特异性PCR引物和探针，利用TaqMan探针技术建立检测该菌的实时荧光定量PCR方法。

其中，特有的基因序列为序列特异性扩增区标记(Sequence characterized amplified region，SCAR)，是通过应用随机引物3S(S15:5'-GGAGGGTGTT-3'，S18:5'-CCACAGCAGT-3'，S103:5'-AGACGTCCAC-3')对Be ATCC 49927、Bh ATCC 49882、BqATCCVR-358、克氏巴尔通体(B.clarridgeiae，Bc)ATCC51734、克勒巴尔通体(B.koehlerae，Bk)ATCC700693、杆菌样巴尔通体(B.bacilliformis，Bb)ATCC35685、文森巴尔通体博格霍夫亚种(B.vinsonii subsp.berkhoffii，Bvb)ATCC51672、文森巴尔通体阿鲁潘亚种(B.vinsonii subsp.arupensis，Bva)ATCC 700727、格拉汉姆巴尔通体(B.grahamii，Bg)ATCC 700132、道志巴尔通体(B.doshiae，Bd)ATCC 700133及特利波契巴尔通体(B.tribocorum，Bt)CIP105476共11种巴尔通体进行RAPD-PCR，依据RAPD图谱中巴尔通体各个种之间的差异扩增带，筛选得到Be的SCAR。

本发明将所述SCAR标记作为目标序列，提供技术方案如下：

本发明首先提供一种用于检测伊丽莎白巴尔通体的TaqMan实时荧光定量PCR引物，所述引物包括：

上游引物BeF：5′-ACACCTGCACAAATAAAACCAAGAT-3′；

下游引物BeR：5′-TTTGCTGTTGTTGGTGTTTGC-3′。

本发明还提供了与前述引物配合使用的探针，所述探针为：

探针BeT：5′-FAM-AGCCATCAAGCCATACAAGACCACCCA-BHQ-3′；

其中，FAM为荧光报告基团，BHQ为荧光淬灭基团。

本发明还提供了含有前述引物及前述探针的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。