[发明专利]实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T-DNA串联重复序列的拷贝数的方法

权利要求书

1.一种实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T-DNA串联重复序列的拷贝数的方法，其特征在于，步骤包括：

(1)通过农杆菌介导的植物转化方法将含有筛选基因BAR的植物表达载体pSKI015连接上HMGA基因，转入到野生型Col-4拟南芥中，获得了300个独立转基因株系；

(2)使用两个参考质粒，其序列为序列表中SEQ ID NO：1、2所示，该两个参考质粒都含有一个编码拟南芥高迁移率蛋白HMGA的内参基因，其中一个质粒是将HMGA基因与PSKI015载体上的BAR基因连接，另一个质粒是将HMGA基因与含有左边界LB和右边界RB的T-DNA正向重复序列连接，分别形成TOPO_HMGA_BAR和TOPO_HMGA_LR两个参考质粒；

将经过草甘膦筛选的转基因拟南芥的RNA进行提取，反转录获得cDNA作为检测的模板，分别使用草甘膦抗性基因和HMGA基因的定量引物进行实用定量PCR的方式检测突变体植物的拷贝数；

计算公式：

t代表目标T-DNA基因，r代表HMGA基因

R_t的公式：R_t＝(F_at×F_ct)/F_bt²

F_at，F_ct，F_bt分表代表植物目标基因的荧光强度。

2.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T-DNA串联重复序列的拷贝数的方法，其特征在于，(1)应用PCR引物5’actttcccaaattgctttttaaaatcc和5’tgacaataatgaatgtttagcattacc，通过PCR方法克隆HMGA基因的DNA全长序列，酶切后连接到植物表达载体pSKI015上，得到pSKI015-HMGA载体。

3.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T-DNA串联重复序列的拷贝数的方法，其特征在于，(2)将构建好的pSKI015-HMGA载体转化农杆菌GV3101，转化后的农杆菌在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选，抗性菌落再经PCR引物5’actttcccaaattgctttttaaaatcc和5’tgacaataatgaatgtttagcattacc验证HMGA基因的有无，含有目的基因的农杆菌再经液体LB的培养，使菌液OD₆₀₀值达到0.8-1.2，将没有开放的拟南芥花序在前述准备好的农杆菌的菌液中浸没1分钟，避光保湿处理一天，之后，将拟南芥放到正常条件下生长，以获得转基因种子，将收获的种子接种在具有草甘膦的抗性筛选培养基上，进行转基因植物的筛选，筛选获得的转基因拟南芥提取RNA，反转录。

4.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T-DNA串联重复序列的拷贝数的方法，其特征在于，(1)中植物生长在16小时-18小时的光/暗条件下的人工气候室，光强为230μE/min/m²，温度为20℃/17℃。