[发明专利]一种坦布苏病毒纳米PCR检测试剂盒及其检验方法

说明书

技术领域

本发明涉及坦布苏病毒的检测技术领域。

背景技术

2010年4月份以来，我国南方部分地区爆发了以蛋鸭产蛋严重下降为主要特征的新的急性传染病。该病临床症状以高热、蛋鸭产蛋量急剧下降为主要特征，剖检可见病死鸭肝脏肿大，有白色点状出血点，卵泡变性，卵泡膜充血、出血。该病发病率几乎100﹪，死亡率可达5%~10%，给蛋鸭养殖业造成了巨大的经济损失。目前已证实，该传染病的病原为坦布苏病毒（tembusu virus，TMUV）。TMUV属于黄病毒科黄病毒属成员，该病毒也可以感染其他水禽以及蛋鸡，引发相同的临床表现。

TMUV的检测方法主要包括传统的病毒分离、环介导等温扩增、聚合酶链式反应（PCR）等，这些方法在病毒检测中发挥了重要作用。其中PCR检测方法由于操作简单，灵敏性高、重复性好等优点被广泛应用。但在实际应用中，PCR技术存在诸多局限性，例如对复杂体系的扩增会出现非特异性产物扩增以及扩增效率不够高等问题。为解决以上问题，寻找可以提高 PCR 特异性和效率的添加剂显得极其重要。

纳米PCR技术是一种新型的PCR技术，其原理是把粒径为1nm～100nm的固相纳米金属颗粒悬浮在液体中形成纳米流体。由于纳米材料具有良好的热传导性，因此在添加了纳米金颗粒的PCR循环体系中，PCR反应会更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，减少非特性扩增，提高特异性扩增产量。因此，目前亟需建立一种能够快速、特异的检测坦布苏病毒的纳米PCR检测手段。

发明内容

本发明针对上述现有技术的不足，提供了一种用于坦布苏病毒检测的纳米PCR试剂盒及其应用，该试剂盒能够快速、特异的检测坦布苏病毒。

本发明所采取的技术方案是：一种用于坦布苏病毒检测的纳米PCR试剂盒，包括5×反转录缓冲液、dNTP Mixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和反转录引物，其特征在于所述试剂盒还包括2×NanoPCR Mix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQ ID No.1所示，所述下游引物的序列为SEQ ID No.2所示。

引物是根据GenBank公布的坦布苏病毒序列，在其E基因保守序列区域设计的一对特异性引物。

优选的，2×NanoPCR Mix由 DNA聚合酶、2×NanoPCR buffer和dNTP Mixture组成。

优选的，反转录酶为M-MLV反转录酶。

优选的，反转录引物的序列为SEQ ID No.2所示。

优选的，所述试剂盒还包括RNA提取试剂：TRIzol LS Reagent、氯仿、异丙醇、75%乙醇。

优选的，所述试剂盒还包括阳性对照。

其中，阳性对照可为将坦布苏病毒接种9-11日龄鸡胚后，收集72～96小时死亡鸡胚的尿囊液。

本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有坦布苏病毒的产品中的应用。

应用所述试剂盒检测待测样品中是否含有坦布苏病毒的方法，包括如下步骤：

1、病毒RNA的提取

（1）将250 μL经过预处理的待测样品加入750 μL TRIzol LS Reagent中，剧烈振荡2 min，室温放置5 min。加入250 μL氯仿，剧烈振荡1min，室温放置5min后，4℃ 12,000 rpm离心15 min，将上层水相转入新的离心管。（2）加入与水相等体积的异丙醇，混匀，室温静置15 min，4℃ 12,000 rpm离心15 min，轻轻倒去上清，然后加入DEPC处理的75%乙醇700～800μL，4℃ 12,000 rpm离心5 min，弃上清。（3）将沉淀自然风干或于50℃干燥箱中晾干，用适量无核酸酶水充分溶解后立即进行PCR或贮存于-80℃备用。

待测样品可为鸡、鸭与鹅的卵巢、输卵管、脾脏、肝脏等组织。其中，待测样品预处理的方法为：将待测样品剪碎后，按照1:5的质量体积比加入生理盐水并研磨均匀，3000～5000rpm离心5～10分钟后取上清，之后再进行RNA的提取。

反转录反应

 取上述步骤所得的病毒总RNA 11 μL，加入2 μL 10μM的反转录引物（SEQ ID No.2），4 μL 5×反转录缓冲液、0.5 μL反转录酶、0.5 μL RNA酶抑制剂、2 μL dNTP Mixture至20 μL，42℃水浴1～2 h，即得到cDNA溶液。

2、纳米PCR反应