[发明专利]一种制备α-1,3GT基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用

权利要求书

1.一种制备α-1,3GT基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建打靶载体：从基因组DNA中分离α-1,3GT基因，经长链PCR方法扩增获得同源臂，与抗生素耐药基因复合构建打靶载体；

(2)将打靶载体转入到胚胎细胞，将重组胚胎细胞注入代孕动物胚胎中，移植到假孕动物体内，与正常动物交配；

(3)对得到的嵌合体动物进行基因型验证，筛选基因成功敲除的阳性基因敲除的嵌合体动物；进一步与野生型动物交配，获得F1代杂合子；F1代杂合子之间交配后获得两条染色体均被剔出的纯合子动物，建系获得基因敲除动物种群。

2.根据权利要求1所述的制备α-1,3GT基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，所述的非人哺乳动物为小鼠，进一步优选C57BL小鼠。

3.根据权利要求1所述的制备α-1,3GT基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，所述的α-1,3GT基因敲除为敲除α-1,3GT基因的功能性催化区第九外显子，其核苷酸序列如SEQ NO ID:1所示。

4.根据权利要求1所述的制备α-1,3GT基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，所述打靶载体含有5`同源臂、耐药抗生素基因NeoR-PA和3`同源臂，用NeoR-PA取代第9外显子。

5.根据权利要求1所述的制备α-1,3GT基因敲除的非人哺乳动物、子代、胚胎或细胞的方法，其特征在于，耐药抗生素基因NeoR-PA 5`端和3`端的同源臂序列取自小鼠第二条染色体上α-1,3GT基因第九外显子的5`端和3`端，分别为4.123kb和7.343kb。

6.根据权利要求2所述的制备α-1,3GT基因敲除的非人哺乳动物的方法，其特征在于，构建打靶载体的步骤为：

(1)从正常C57BL/6J小鼠分离基因组DNA，扩增第9外显子5’端C1片段、A片段和3’端B片段、C2片段，分别连接到pBlunt载体；

(2)将酶切鉴定、测序正确的A和B片段依次连接到pL452载体得到pL452-α-1,3GT-A-B，同时，通过Overlap PCR将测序正确的C1、C2片段融合后连接到pDTA-Down载体上；

(3)将连接正确的pL452-α-1,3GT-A-B用EcoRV酶切，pL452-AB切出2885bp、2930bp两条带，回收目的片段A-NeoR-B，电转含pBCTG的BAC菌进行重组；菌落PCR检测A-NeoR-B片段重组BAC，鉴定扩增条带正确；

(4)pDTA-down-α-1,3GT-C的线性化处理，即EcoRV酶切处理pDTA-Down-α-1,3GT-C，回收目的条带，电转已经重组了NeoR的α-1,3GT的BAC菌；pDTA-α-1,3GT-C拯救α-1,3GT-NeoR BAC(AmpR+KanR)；对C拯救后的菌落进行PCR检测鉴定，将重组正确克隆进行扩增，经Stbl3纯化后酶切验证。

7.根据权利要求1所述的制备α-1,3GT基因敲除的非哺乳动物、子代、胚胎或细胞的方法，其特征在于，步骤(2)包括以下步骤：制备不育雄鼠和假孕母鼠；超排卵；收获受精卵；目的DNA的制备；将目的DNA导入受精卵；受精卵的移植；首建鼠中目的DNA整合情况的检测；通过杂交繁育基因剔出小鼠种系。

8.一种来自权利要求1所述的基因敲除动物的精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组织或细胞。

9.一种如权利要求1所述的基因敲除的非人哺乳动物或如权利要求8所述的精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、组织或细胞在生物源性材料中的应用和在α-Gal抗原介导的肿瘤免疫的应用；所述生物源性材料包括动物源性或取自人体的，所述的动物源性生物材料不包括灵长类动物；所述的动物源性生物材料的种类包括取自动物体内的各种组织、脏器及其衍生物，或者由组织或脏器制备的各种材料；所述的灵长类动物优选古世纪猴、狒狒。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用包括在免疫学研究、免疫毒理学、异种移植的免疫排斥反应及其机理的研究、安全性评价中的应用。所述的免疫学研究包括α-Gal抗原介导的异种动物组织、器官或动物源性生物材料和肿瘤免疫的研究；所述的安全性评价包括生物源性材料，优选动物源性生物材料在临床实验研究前的安全性评价和GGTA1(α-1,3GT)基因敲除猪、牛等动物组织、器官移植的免疫学评价。