[发明专利]一种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种病毒的检测试剂盒，特别是一种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒及方法。

背景技术

虽然Crandell和Maurer在1958年就从美国患呼吸道疾病的仔猫体中分离到猫传染性鼻气管炎病毒(FHV-1)，但是国内却没有从猫体内分离到FHV-1的报道，只有1例2014年在华南虎体内分离到虎源性FHV-1的报道，所以对于了解国内该病毒的感染现状、病原特性及与疫苗毒的基因差异尤为重要。近几年，随着人们生活水平的提高，猫和犬一样已逐渐成为人民的生活伴侣和精神慰藉的重要载体，宠物猫在上海宠物市场已占有相当大的比例，而且这种比例呈逐年增长的趋势，所以猫的传染性疾病已引起相当的重视，而FHV-1引起的猫的呼吸道疾病已成为宠物猫重要的传染病之一，其引起的城市公共安全问题也日益凸显。目前，很多城市小区的流浪猫很多，且繁殖能力强，极易造成病毒的自循环，使流浪猫成为病毒库和传染源，因此应当加强该病的研究和防控，防止其成为家庭宠物和观赏类猫科动物的致命杀手。

目前，对于该病的病原学检测市场上还没有成熟的检测试剂盒和荧光定量PCR方法，所以迫切需要建立一种猫传染性鼻气管炎病毒检测试剂盒及其检测方法，加强对该病诊断的准确性，提高其诊疗效果。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒及方法，所述的这种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒及方法要解决现有技术中检测猫传染性鼻气管炎病毒的方法复杂、准确性不高的技术问题。

本发明提供了一种检测猫传染性鼻气管炎病毒的试剂盒，含有：

(1)特异性引物，其中上游引物FHV-1F的序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物FHV-1R的序列如SEQ ID NO：2所示；

(2)特异性探针FHV-1Probe，序列如SEQ ID NO：3所示，在特异性探针FHV-1Probe的5’设计有荧光物质FAM，在特异性探针FHV-1Probe的3’设计有带有淬灭物质TAMRA。

进一步的，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂、Taq酶、PCR缓冲液、DNA聚合酶中的任意一种或者一种以上的组合。

本发明还提供了采用上述的试剂盒检测猫传染性鼻气管炎病毒的方法，包括如下步骤：

1)一个样本处理的步骤，从样本中提取DNA；

2)一个荧光PCR的步骤，按照检测样品数n(n＝待检样品数+2)取荧光PCR试剂、上下游引物和探针混于一离心管中，于涡旋振荡器上振荡，按每管分装，盖上管盖备用，将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置荧光PCR仪中，荧光信号在60℃时收集，检测通道：FAM；

3)一个结果判定的步骤，若样品Ct值＞35或无数值的标本为阴性；若样品Ct值≤30的标本为FHV-1阳性样品；若30＜Ct值≤35的样本建议重做，重做结果Ct值为none为阴性，否则为阳性。

进一步的，荧光PCR反应条件：95℃，30s；40个循环，95℃，5s；60℃，34s。

进一步的，荧光PCR试剂由2×TaqMan Master Mix商品化试剂代替。

进一步的，上述的检测方法还包括一个如下的质控标准：

(1)阴性对照的Ct值应等于none；

(2)阳性对照的Ct值应≤30，否则，此实验视为无效(Ct值应以S型曲线拐点的循环数为准)；

(3)应该同时满足上述2项条件，否则试验无效。

进一步的，上游引物FHV-1F的序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物FHV-1R的序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步的，特异性探针FHV-1Probe，序列如SEQ ID NO：3所示，在探针F的5’设计有荧光物质FAM，在探针FHV-1Probe的3’设计有带有淬灭物质TAMRA。

本发明还提供了上述试剂盒的用途，用于从待测样品中检测猫传染性鼻气管炎病毒。

本发明是根据猫传染性鼻气管炎病毒(FHV-1)基因序列设计了一对特异性引物，其作用是能够特异性扩增FHV-1的DNA片段。根据设计的引物扩增出的DNA片段设计探针，其作用是特异性结合扩增出的DNA片段，在PCR扩增中释放FAM荧光信号，当荧光PCR仪通过相应的通道采集荧光时，就可以特异性观察到扩增曲线，达到检测FHV-1的目的。