[发明专利]一种黑牛肝菌母种长期保藏方法

说明书

技术领域

本发明涉及菌种保藏领域，具体而言，涉及一种黑牛肝菌母种长期保藏方法。

背景技术

黑牛肝菌(Phlebopus portentosus)，是一种珍贵的热带食用菌，深受出产地人们的喜爱，也是此属中唯一可以使用腐生方法栽培的食用菌，目前已可用袋栽及瓶栽的方法进行中等规模的栽培推广。黑牛肝菌是一种高温食用菌，菌丝体不耐低温，微生物及一般食用菌菌种常用的低温(4℃)保藏法，保藏黑牛肝菌菌种24小时死亡率100％。因此，菌种的中短期保藏需要保存在中温条件下进行，而长期保藏未见报道。黑牛肝菌是一种新型的可进行人工栽培的小牛肝菌科真菌，获得一株具有商业栽培价值的菌株极其困难，加之菌种的不耐低温及中短期保藏多次转接产生的退化，限制了黑牛肝菌的研发及产业化栽培。

常规液氮保藏方法使用甘油或二甲亚砜，而黑牛肝菌在这些保护剂下不萌发或复苏后退化现象明显；由于是高温菇，中低温菇的预冷方式(如降温速率为1℃降温至-40℃再移入液氮中)并不适合，萌发率并不高；常用38℃水温下水浴复苏本菌种萌发率为0。保藏菌种常采用长满斜面或平皿菌种，其他一些食用菌菌丝生长速度快，长满斜面或平皿只需10d左右，菌丝旺盛，而本菌种需要25-30天，此时液泡过大，胞液结晶时对菌丝损伤大，不适合保藏。因此，中低温食用菌液氮保藏方法并不适合本菌种，急需寻求一种适宜黑牛肝菌菌种长期保藏的方法，提高其菌种的稳定性，为黑牛肝菌的研发以及实现其产业化栽培提供菌种保障。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑牛肝菌母种长期保藏方法，以提高黑牛肝菌的稳定性，为黑牛肝菌的研发以及实现其产业化栽培提供菌种保障。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种黑牛肝菌母种长期保藏方法，以海藻糖作为保护剂保藏黑牛肝菌母种。

本发明提供的一种黑牛肝菌母种长期保藏方法，选用海藻糖作为保护剂保藏黑牛肝菌母种，彻底解决了黑牛肝菌菌种长期保藏问题，其操作简单，成本低廉，并且不易退化和变异，成活率高，具有良好的应用前景。同时，也为其他高温食用菌菌种保藏技术的完善提供积极的促进作用。

为了防止保藏过程中发生退化和变异，提升保藏后的黑牛肝菌的稳定性，使保藏后成活率高，优选地，所述保护剂为质量百分数为20％-40％的海藻糖水溶液。

优选地，所述黑牛肝菌母种具有以下特征：

颜色乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好。

颜色乳黄至金色，说明菌丝生长旺盛；而菌皮、菌索以及吐水是菌丝生长老化的特征。本发明保藏的黑牛肝菌母种处于生长旺盛阶段，母种在保藏过程中对外界抗逆性强，能很好的保持自身的性状。

进一步地，所述黑牛肝菌母种通过以下培养方式获得：

将菌丝块接种于母种培养基上，于28-30℃恒温培养15～20天。

菌丝块是由黑牛肝菌子实体的组织块培养得到，用于短期保藏的菌种。即直接取短期保藏的菌丝块进行培养，至其颜色乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好即可。得到的母种处于生长旺盛阶段。

此外，黑牛肝菌母种也可以直接将黑牛肝菌子实体的组织块培养获得，即将黑牛肝菌子实体的组织块于28-30℃恒温培养28-32天，至其颜色乳黄色至金色，无菌皮，无菌索，无吐水，延展性好即可。

进一步地，所述母种培养基包含以下成分：

该母种培养基能很好的满足黑牛肝菌生长需求，黑牛肝菌在该培养基上生长旺盛，得到的菌丝多。

进一步地，保藏过程具体为：

将所述黑牛肝菌母种浸入保护剂中，先在-110℃～-130℃条件下预冷30min～60min，然后放入液态氮或气相氮中保藏。

黑牛肝菌母种浸入保护剂中，先于较低温度下预冷，使黑牛肝菌母种适应一段时间后再放入液氮中长期保藏，经过这样的处理，尽量减少了对黑牛肝菌母种的损伤。

进一步地，将所述黑牛肝菌母种按无菌操作装入已灭菌的低温冻存管中，使所述黑牛肝菌母种放入无菌的保护剂中。保藏所用的黑牛肝菌母种、冻存管以及保护剂均为无菌的状态，以防止其他杂菌对黑牛肝菌母种的破坏。

为了进一步保持黑牛肝菌母种处于无菌的状态，并防止外界环境的干扰，优选地，所述低温冻存管扭紧管塞后再用医用胶带封口。

为了复苏过程中尽量减少对黑牛肝菌母种的损害，优选地，复苏时，取出所述低温冻存管，放入39℃～42℃的恒温温水中快速恢复至室温。