[发明专利]一种利用海藻酸钙小球调节细菌纤维素结构的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用海藻酸钙小球调节细菌纤维素结构的方法，属于生物材料制备领域。

背景技术

细菌纤维素（Bacterial cellulose，简称BC）是由多种微生物分泌合成的一种胞外多糖，静置条件下培养，会在培养液-空气表面形成一种水凝胶膜。BC与植物纤维素（Plant cellulose，简称PC）具有相同的化学组成成分，但相比于PC，BC具有一些优越的性能，如拉伸强度高，纯度高，生物相容性好，且具有三维纳米网络结构。

基于BC的优良性能，BC已作为再生组织用于人造皮肤、血管移植等。但BC的纤维网络尺寸过小，使哺乳动物细胞在培养过程中不能渗透生长进入BC内部，限制了BC在组织工程材料上的应用。目前已发展多种提高细胞孔隙率，改变细胞空洞结构的方法，多种文献均有报道（¹Baah-Dwomoh A, Rolong A, Gatenholm P, et al. The feasibility of using irreversible electroporation to introduce pores in bacterial cellulose scaffolds for tissue engineering. Appl Microbial Biotechnol, 2015:1-10. ²Yin N, Stilwell M D, Santos T M A, et al. Agarose particle-templated porous bacterial cellulose and its application in cartilage growth in vitro. Acta biomaterialia, 2015, 12:129-138. ³ Andersson J, Stenhamre H, B?ckdahl H, Gatenholm P. Behavior of human chondrocytes in engineered porous bacterial cellulose scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2010, 94A:1124–1132.），如发酵过程中掺入石蜡小球、淀粉颗粒及琼脂小球等，但这些方法都存在一定的缺陷，如石蜡不易除去，反复处理会对已形成的孔洞结构造成破坏，淀粉颗粒会发生沉淀，制孔效果不明显，琼脂小球不易灭菌，BC培养过程存在染菌风险。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效调节细菌纤维素三维结构的方法。

本发明的原理是：木醋杆菌（Acetobacter xylinum RZS.1，简称A. xy RZS.1）是一种严格好氧菌，是BC生产的模式菌株。本发明中使用A. xy RZS.1，通过静态培养，获得正在生长的BC膜，向BC膜上铺撒海藻酸钙小球，利用A. xy RZS.1的好氧性及对营养的趋向性，细胞会穿过海藻酸钙小球向空气界面渗透移动，在随后合成BC的过程中，会将海藻酸钙小球包裹进纤维素网络结构中。由于通过静电纺丝条件的改变，调节海藻酸钙小球的大小，且获得的小球尺寸均一，这样可以制备不同孔径结构的BC。海藻酸钙小球是由钙离子交联的多糖，易于去除，在后处理的过程中不会对已调节形成的三维结构造成明显的影响。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种利用海藻酸钙小球调节细菌纤维素结构的方法，包括如下步骤：

第一步：分别配制5-30 g/L的海藻酸钠溶液和10-100 g/L氯化钙溶液（氯化钙用作交联剂），控制流速5-20 ml/h、电压4-20 kV，采用静电纺丝技术制备海藻酸钙小球，将小球固定化2-36 h后，115-121℃灭菌15-30 min，冷却至室温，备用；

第二步：木醋杆菌进行种子扩增培养；

第三步：制备发酵液；

第四步：接种后，在25-32℃条件下进行静态培养，静态培养1-5天后，在已形成的细菌纤维素凝胶表面均匀铺撒上海藻酸钙小球，继续静态培养；

第五步：静态培养结束后，取出上层膜，用0.1-1mol/L EDTA溶液溶解海藻酸钙小球；

第六步：去除残留的细胞及发酵液，用去离子水冲洗BC膜至中性。