[发明专利]一种泰拉霉素的半抗原和完全抗原的合成方法有效
申请号: | 201510106846.8 | 申请日: | 2015-03-11 |
公开(公告)号: | CN104710488B | 公开(公告)日: | 2017-09-15 |
发明(设计)人: | 孙秀兰;朱欣凤;张银志 | 申请(专利权)人: | 江南大学 |
主分类号: | C07H17/00 | 分类号: | C07H17/00;C07H1/00;C07K14/765;C07K14/77;C07K16/44;G01N33/68 |
代理公司: | 北京爱普纳杰专利代理事务所(特殊普通合伙)11419 | 代理人: | 张勇 |
地址: | 214122 江苏*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 霉素 半抗原 完全 抗原 合成 方法 | ||
技术领域
本发明涉及一种泰拉霉素的半抗原和完全抗原的合成方法,属于免疫学技术领域。
背景技术
泰拉霉素(Tulathromycin,C41H79N3O12),是中国2008年批准使用的一种动物专用的半合成大环内酯类抗生素。泰拉霉素药效强、用量少,将会逐渐替代已经产生抗药性的泰乐菌素和替米考星等现有的大环内酯类抗生素,应用潜力巨大。
泰拉霉素的残留分析方法的研究十分必要。目前主要利用放射性标记测定法和HPLC-MS-MS测定泰拉霉素残留。后者较为常用,但是样本前处理复杂、测定过程繁琐、仪器使用成本高,不能满足现场快检的要求。而免疫分析方法具有样本前处理简单、仪器设备费用低、灵敏度高、特异性强等优点,在抗生素残留现场筛选和大量样品快速检测中具有显著的优势。但是目前国内外还没有泰拉霉素酶联免疫吸附检测法(ELISA)的相关报道。
发明内容
本研究首次成功合成了泰拉霉素完全抗原。首先将泰拉霉素改造为具有活性羧基的半抗原。采用活泼酯法合成免疫原泰拉霉素-BSA和包被原泰拉霉素-OVA,为泰拉霉素检测试剂盒的研制开辟了道路。
本发明的第一个目的是提供一种泰拉霉素半抗原。所述半抗原,其合成方法是:按每4-5mg泰拉霉素标准品溶于400-500μL的无水吡啶中,加入1-2mg的丁二酸酐,于90-114℃回流搅拌反应6-9h,氮气吹干反应液,即得泰拉霉素半抗原。
所述泰拉霉素半抗原,在本发明的一种实施方式中,其合成反应方程式如图1所示。合成的半抗原,即衍生后的泰拉霉素具有活性羧基,可以与载体蛋白偶联。
所述泰拉霉素半抗原的结构式,在本发明的一种实施方式中,如下:
所述半抗原,在本发明的一种实施方式中,是采用液质连用(LC-MS)的方法进行鉴定。
本发明的第二个目的是提供一种利用所述半抗原合成泰拉霉素完全抗原的方法。
所述合成泰拉霉素完全抗原方法,包括:(1)按每1mg泰拉霉素半抗原,与0.6-1.0mg的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺)、0.4-0.8mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶于300-400μl的DMF(N,N-二甲基甲酰胺),室温搅拌反应30-60min,即得到活化好的泰拉霉素衍生物;(2)将6-8mg的载体蛋白溶于2.0-2.5mL的PBS,将上一步活化好的泰拉霉素衍生物边搅拌边逐滴加入载体蛋白溶液中,2-8℃反应12-16h,反应结束后,用PBS透析,即得到泰拉霉素完全抗原。
所述合成完全抗原方法,在本发明的一种实施方式中,具体是:(1)泰拉霉素半抗原的制备:取4mg泰拉霉素标准品溶于500μl无水吡啶中,加入1mg丁二酸酐,114℃回流搅拌反应6h得泰拉霉素半抗原,氮气吹干反应液;(2)泰拉霉素完全抗原的制备:将1mg泰拉霉素衍生得到的产物(即半抗原)、0.6mg EDC、0.4mg NHS溶于300μlDMF,室温搅拌反应30min;6mg载体蛋白溶于2mL PBS,将活化好的泰拉霉素衍生物边搅拌边逐滴加入载体蛋白溶液中,4℃反应过夜;反应结束后,用PBS透析3d,每6h换一次液。
所述合成完全抗原方法得到的完全抗原,分装后冷冻干燥,-20℃保藏。
所述载体蛋白,在本发明的一种实施方式中,是BSA或OVA。
本发明的第三个目的是提供一种按所述方法得到的泰拉霉素完全抗原。
所述完全抗原,采用如下方法进行鉴定:用50%甲醇PBS溶液做稀释液,取0.1mg/mL BSA、0.01mg/mL泰拉霉素和0.1mg/mLBSA的混合物,0.1mg/mLBSA-泰拉霉素偶联物,0.01mg/mL泰拉霉素于1cm石英比色皿中,设置空白对照为50%甲醇PBS溶液。激发波长为278nm,激发和发射单色仪的狭缝宽度均为5nm,扫面速度为300nm/min,扫描范围300-500,进行荧光发射光谱扫描测定。
本发明还提供了一种鉴定或应用所述泰拉霉素完全抗原的方法,是按照100μg/只的剂量,皮下注射免疫五只雌性Balb/c小鼠。初次免疫将免疫原与完全弗氏佐剂按照1:1混合。以后将免疫原与不完全弗氏佐剂按照1:1混合每间隔两周进行一次加强免疫。三免后尾部取血间接法测定效价。
本发明的有益效果:
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