[发明专利]一种大鼠血管内皮细胞体外培养方法

权利要求书

1.一种大鼠血管内皮细胞体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取大鼠主动脉，用无菌PBS液进行冲洗，然后将其沉浸在含肝素的DMEM/F12培养液中以备用；

(2)将系上尼龙线的无菌针线穿过主动脉内腔后将无菌针剪下，利用尼龙线在主动脉一末端打结固定；固定尼龙线未打结的一端，拉扯主动脉外膜将分离的主动脉沿打结端翻转，直到整个主动脉是主动脉内膜朝外主动脉外膜朝内；

(3)将翻转后的主动脉放在胶原酶中消化；

(4)在37℃温箱中培育后，将被消化的主动脉放入无血清的DMEM/F12培养液，将主动脉两端结点剪去使其成为中空管状样，沿纵向剪开并将其分割成小块的主动脉薄片备用；

(5)将主动脉薄片进行贴壁培养，所述主动脉薄片的主动脉内膜部分浸入含肝素和血清的DMEM/F12培养液，每隔48h更换一次培养液；

(6)第3-5天，移除主动脉薄片，之后每天更换培养液，所述培养液与步骤(5)相同，第9天即可获得大量的血管内皮细胞，第14天后可用于细胞传代。

2.根据权利要求1所述的大鼠血管内皮细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤(1)中的DMEM/F12培养液含1000U/ml肝素。

3.根据权利要求1所述的大鼠血管内皮细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中胶原酶为II型胶原酶或I型胶原酶。

4.根据权利要求3所述的大鼠血管内皮细胞体外培养方法，其特征在于：所述II型胶原酶或I型胶原酶的浓度为2g/L。

5.根据权利要求1所述的大鼠血管内皮细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤(4)中37℃温箱中培育60分钟。

6.根据权利要求1所述的大鼠血管内皮细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤(4)的主动脉可分割为4－5块主动脉薄片，所述主动脉薄片的大小为2cm*4cm。

7.根据权利要求1所述的大鼠血管内皮细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤(5)的DMEM/F12培养液中血清含量为20％、肝素含量为50ug/ml。

8.根据权利要求1－7任一项所述的大鼠血管内皮细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中利用无菌针线将主动脉内膜翻转出来，并在两端打结的具体方法为：用一根无菌细针系上4-0尼龙线，将无菌针线穿过主动脉内腔，穿过后将无菌针剪下，利用尼龙线在主动脉一末端打结固定；利用眼科镊固定尼龙线未打结的一端，然后利用另一个眼科镊将分离的主动脉沿打结端翻转，轻轻的拉扯主动脉外膜直到整个主动脉是主动脉内膜朝外主动脉外膜朝内，将翻转后的主动脉未打结的一端打结。

9.根据权利要求1－7任一项所述的大鼠血管内皮细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤(5)中贴壁培养的方式为，将主动脉薄片平铺在六孔板上，六孔板中每孔加入800ul含肝素和血清的DMEM/F12培养液以便仅仅使主动脉内膜沉浸在培养液中。

10.根据权利要求9所述的大鼠血管内皮细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤(6)中移除主动脉薄片后，每天更换培养液，加入量为3ml/孔。