[发明专利]EV71病毒VP1重组抗原及其单克隆抗体与应用

说明书

本发明公开了一组EV71病毒VP1重组抗原，是由SEQ ID No.1～SEQ ID No.11所示的11种氨基酸序列分别与柔性短肽氨基酸序列连接制得。本发明还公开了能与所述EV71病毒VP1重组抗原特异性结合的单克隆抗体，以及所述抗原在制备EV71病毒抗原或抗体检测试剂盒中的应用。本发明提供的重组抗原和单克隆抗体具有高灵敏度、高特异性等特点，是可以作为研制EV71病毒检测试剂的关键原料。

技术领域

本发明涉及一组肠道病毒71型(EV71)病毒VP1重组抗原及其单克隆抗体与应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

手足口病(Hand foot mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的一种全球性常见的急性传染病。该病多发生于5岁以下儿童，主要表现为口痛、厌食、低热、手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，少数患儿可引起心肌炎等并发症。个别重症患儿病情发展快，导致死亡。手足口病是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)。目前国内爆发的手足口病以柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV 71)引起最为常见。Cox A16引起的手足口病一般症状较轻，容易自愈。感染EV71病症则相对较重，20％患者可能出现重症炎症及伤害中枢系统造成后遗症。故早发现早诊断可有效降低该病毒传播风险，并有助于患者得到及时治疗。因此，开发好研制有关EV71病毒检测试剂和方法显得尤为重要。

肠道病毒71型(EV 71)于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来。病毒基因组为单股正链RNA，全长约7.5kb，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白。该蛋白可进一步被水解成P1、P2、P3 3个前体蛋白；其中P1蛋白可分解为VP1、VP2、VP3和VP4四个外壳蛋白。VP1、VP2、VP3暴露在病毒衣壳蛋白的表面，具有大量抗原决定簇，而其中的VP1是最主要的衣壳蛋白，具有最多的特异性中和位点，因此，VP1蛋白的编码基因序列与病毒血清具有较高的相关性，常被用于病毒的鉴定和进化分析。

高相关的EV71病毒抗原和抗体是EV71病毒检测试剂制备的关键。近年来，基因工程的发展为研制EV71病毒抗原和抗体提供了良好基础。故加强研制EV71病毒VP1特异性抗原和其单克隆抗体，对开发更加有效的早期诊断EV71的方法和试剂盒具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于提供一组EV71病毒VP1重组抗原及其单克隆抗体与应用。

本发明所述的EV71病毒VP1重组抗原，其特征在于：所述重组抗原由SEQ ID No.1～SEQ ID No.11所示的11种氨基酸序列分别与柔性短肽氨基酸序列连接制得；其中，所述柔性短肽氨基酸序列是：GGGGS或GGGGSGGGGSGGGGS或AAY，所述11种氨基酸序列分别与柔性短肽氨基酸序列连接时，每种氨基酸序列均重复3次。

进一步的，所述重组抗原有11种，其编号为EV71 VP1 1号～EV71 VP1 11号，其中EV71 VP1 1号～EV71 VP1 11号重组抗原的核苷酸序列由SEQ ID No.12～SEQ ID No.22所示。

基于对手足口病不同疫区的EV71病毒的研究，本发明进一步综合分析了国内外有关EV71的文献，确定了EV71的VP1蛋白作为抗原靶位的主要研究对象。通过多种生物信息学数据库及生物信息学软件对VP1基因及其编码蛋白序列对比分析，考虑氨基酸序列亲水性，对VP1抗原表位预测，筛选得到上述EV71病毒11种潜在高交叉反应性的线性亲水表位氨基酸序列，合成基因重组表达，并经过实验验证具有高交叉反应，其氨基酸序列具体为：

VP1(10-20AA)SEQ ID NO1：SSIGDSVSRAL

VP1(25-40AA)SEQ ID NO2：PAPTGQNTQVSSHRLD

VP1(51-65AA)SEQ ID NO3：EIGASSNASDESMIE