[发明专利]一种以葡萄糖为底物筛选富集嗜盐高聚PHA混合菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种选择富集具有聚羟基脂肪酸酯(PHA)积累能力的混合菌群的方法，尤其是以葡萄糖为底物以天然入海口底泥为接种物在高盐条件下选择富集具有PHA积累能力嗜盐混合菌的方法。该方法作为两步法生产PHA的第一步，可以为后续发酵生产PHA提供菌群，降低PHA生产成本。该方法属于生物生产PHA技术领域。

背景技术

目前，以石油为原料生产的塑料已经广泛应用于各个行业中。然而废弃塑料带来的“白色污染”和垃圾围城现象以及塑料燃烧产生的大气污染、水污染严重地影响了人们的生活环境。因此，生物可降解塑料作为以石油为原料生产的塑料的替代品受到了广泛的关注。聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类微生物在体内积累碳源形成的胞内聚合物。PHA具有良好的物理特性、生物相容性和生物可降解性，被认为是未来替代化工塑料的重要物质。目前，工业生产PHA多以纯菌发酵，其高昂的成本限制了其广泛应用。底物成本、细胞内PHA含量以及PHA提取方法是影响生物生产PHA成本的最主要因素。为此，可以通过使用廉价发酵底物、提高细胞内PHA含量、减少或者取消灭菌程序、简化提取PHA程序等方式降低PHA的生产成本。嗜盐微生物是生长在高盐环境中的一类特殊微生物，具有特殊的细胞结构、生理机能、遗传基因和适应机制。研究已经发现了很多嗜盐菌具有高的PHA积累能力。高盐环境阻止了其他非嗜盐微生物的生长，菌种保持不需要灭菌程序，可以以开放的方式进行PHA生产；此外，由于嗜盐微生物细胞内部具有高渗透压，一旦进入淡水低渗环境就会迅速导致细胞壁的破裂，实现快速的PHA释放。不使用药剂破壁回收PHA降低了PHA成本；最后，嗜盐微生物可以利用多种废弃有机物发酵生产PHA，降低PHA生产的底物成本。综上可以看出，嗜盐菌生产PHA在成本上具有较大的优势。

目前，生物生产PHA普遍采用两步法。即第一步实现对PHA积累菌群的选择富集，第二步利用这些微生物发酵底物生产PHA。在两步法工艺中，第一步富集高聚PHA能力的菌群是最关键一步。这一步将直接影响后续发酵生产PHA的产量以及能否使用廉价废弃物作为底物生产PHA。目前对PHA积累微生物的选择富集通用的方式是以乙酸作为底物采用动态生产(ADF)的方式选择种群。但是，以这种方式筛选的种群在第二步发酵时只能使用乙酸作为底物生产PHA，无法使用其他底物。乙酸是一种价格昂贵的底物。如果以乙酸为底物生产PHA，PHA生产成本中乙酸的成本就贡献了40％。为此，在两步法生产PHA的工艺中，在第一步建立一种PHA积累菌群的选择方法，实现在第二步利用低成本底物甚至废弃物发酵PHA是非常重要的。这样的方法可以大大降低PHA的生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以葡萄糖为底物以天然入海口底泥为接种物选择富集积累PHA嗜盐混合菌的方法。该方法最大可能地提高了PHA产量，降低了PHA生产成本。

以葡萄糖为底物筛选嗜盐PHA积累混合菌的方法，主要包括以下步骤：

步骤1，采集入海口底泥接种到公知的SBR反应器中，接种的污泥混合液占SBR总体积的1/4-1/5；

步骤2，向反应器中注满底物溶液：该底物每升水溶液中含：0.5-2.0g葡萄糖，微生物生长必需的其他元素，如底物每升水溶液中采用以下物质提供微生物生长必须的其他元素：0.11g NH₄Cl，30.0g NaCl，45.0mg MgCl₂·6H₂O，113.3mg NH₄Cl，26.0mg KH₂PO₄，7.6mg KCl，3.0mg FeSO₄·7H₂O，1.5mg ZnSO₄·7H₂O，8.0mg CaCl₂·2H₂O，1.2mg MnSO₄·H₂O；

步骤3，采用间歇方式运行SBR反应器，启动SBR反应器的搅拌转置和曝气装置，搅拌速率为60-120r/min，向反应器中匀速注入空气，控制底物溶液中溶解氧在2-4mg/L，连续运行10-12h，pH范围为6.5-7.5，运行过程中不调节pH，反应器以控温设备控制温度在30±0.1℃；

步骤4，关闭搅拌装置和曝气装置，静置10min-60min；

步骤5，排除SBR反应器中的上清液，保留活性污泥；

步骤6，排除SBR反应器中的污泥的1/10；