[发明专利]利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法

权利要求书

1.一种利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）提供人溶菌酶和抗菌肽Parasin I蛋白的氨基酸序列，以及根据毕赤酵母密码子优化后的重组基因序列hLY-PI；

（2）构建酵母细胞中表达hLY-PI的重组质粒pPICZαA- hLY-PI；

（3）重组质粒pPICZαA-hLY-PI转化毕赤酵母X-33细胞；

（4）鉴定并筛选高表达转化菌株；

（5）培养转化菌，获得人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白；

（6）人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的鉴定及酶学活性分析。

2.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，其特征在于所述步骤（1）中人溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述抗菌肽Parasin I蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，其特征在于所述步骤（1）中根据毕赤酵母密码子优化后的重组基因序列hLY-PI是在SEQ ID NO:1序列的前面加上6个组氨酸，在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的中间加上柔性氨基酸和肠激酶切割位点，如SEQ ID NO:3所示；然后依据毕赤酵母的密码子偏好性进行密码子优化后的重组基因序列hLY-PI，如SEQ ID NO:4所示。

4.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，其特征在于所述步骤（3）中，重组质粒转化方法是电转化法，采用Bio-rad公司电转化仪预设PIC程序。

5.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，其特征在于所述步骤（4）中，筛选转化菌方法是用荧光定量PCR的方法对高表达转化菌进行筛选、鉴定。

6.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，其特征在于所述步骤（5）中，培养转化菌培养条件为30℃，200 r/min，0.5%的甲醇，3-4天。

7.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，其特征在于所述步骤（5）中重组人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白存在于培养酵母菌X-33的菌液上清。

8.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，其特征在于所述步骤（6）中，所述的人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的鉴定方法是过6×His标签介质，纯化，酶切，进行SDS-PAGE电泳。

9.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法，其特征在于所述步骤（6）中，所述的人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的酶学活性分析是用抑菌实验来检测。