[发明专利]一种转脂滴包被蛋白基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程和生物防治技术领域，具体地说是一种转脂滴包被蛋白基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株。

背景技术

粉红螺旋聚孢霉Clonostachys rosea，原名：粉红粘帚霉Gliocladium roseum，是一类重要的菌寄生菌，可通过缠绕、穿刺等方式侵染核盘菌、灰葡萄孢、镰刀菌和丝核菌等多种植物病原真菌，同时还可以产生抑菌物质抑制病原菌的生长，促进植株生长，诱导植物抗性，因而具有巨大的生防潜力。但现有技术中缺乏高致病力菌株、缺少优良菌株规模化培养技术是制约其在植物病害防治领域广泛应用的关键因素。

现有技术表明脂酶类在植物抗病中起重要作用，其中脂滴包被蛋白是一类调节脂肪代谢的磷蛋白，它的调节是一种双向调控代谢，在基础状态下脂滴包被蛋白蛋锚定于脂滴表面作为生理屏障，防止被胞浆内的脂酶水解；在缺乏能量的特殊情况下受到脂解刺激，脂滴断裂，形成许多小脂滴，总表面积增大，但脂滴包被蛋白数量没有明显的增加，因此脂滴包被蛋白的保护作用相对减弱，使得脂滴分解。在金龟子绿僵菌侵染蝗虫研究中，脂滴包被蛋白通过调节脂滴代谢来影响附着胞的膨压，该基因缺失突变株中脂滴由于失去了脂滴包被蛋白的保护作用而被分解，最终导致突变株附着胞膨压减小及附着胞畸变，从而降低了对蝗虫表皮的穿透能力。

粉红螺旋聚孢霉菌株HLD-1是一种高效菌寄生菌，中国微生物菌种保藏中心保藏编号CGMCC No.1037，对菌核的寄生率能够达到100％，并且对灰霉病菌、立枯丝核菌和镰刀菌等病原真菌也表现出强烈的寄生作用和明显的抑制作用，但存在防效不稳定的问题，通过遗传改良进一步提高该生防菌株抗病性能具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种转脂滴包被蛋白基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株及其应用，解决现有技术中缺乏高致病力菌株以及现有粉红螺旋聚孢霉防效不稳定的问题。

一种转脂滴包被蛋白基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株，命名为Cr-per44，在中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心的保藏登记号为CGMCC No.10028，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

上述工程菌株Cr-per44的培养特征为：在PDA培养基上生长较快，26℃下培养10d菌落直径可达8～9cm，见图1。菌落毡状，初始为白色，产孢后逐渐变成灰绿色。适宜的生长、 产孢温度为25～28℃，最适pH值为6～7，且对光照较为敏感。镜检形态为：菌丝无色、分隔，分生孢子梗直立，可产生2～3级帚状分枝，瓶梗顶端产生大量分生孢子，聚集成球状。孢子卵形或圆柱形，直径3～5μm。

上述工程菌株Cr-per44的构建方法为：

1)酶切pAN7-1载体获取线性化pAN7-1载体，将线性化pAN7-1载体与脂滴包被蛋白目的片段融合拼接，获得转化载体；

2)对粉红螺旋聚孢霉HLD-1菌株进行培养，筛选收集幼龄菌丝，将幼龄菌丝与蜗牛酶进行混合酶解，过滤并离心，收集原生质体沉淀物，用STC溶液溶解后获取原生质体溶液；

3)将转化载体与原生质体溶液混合静置，通过液体培养基TB3进行复苏，振荡培养，离心去除上清液，通过STC溶液悬浮沉淀后，与TB3培养基混合后倒板培养，获得稳定遗传的转化子，从中挑取阳性转化子。

上述挑取阳性转化子的方法为：提取稳定遗传的转化子RNA，反转录获得cDNA，PCR扩增后采用琼脂糖凝胶电泳检测，挑取阳性转化子。

上述工程菌株Cr-per44在制备微生物杀菌剂中的应用。

一种含有上述工程菌株Cr-per44的菌剂。

上述含有工程菌株Cr-per44的菌剂的制备方法：

首先将重组菌株Cr-per44在PDA平板上培养，7～10d后切取菌块，然后将切取的菌块置于PD培养液上振荡培养，最后向培养液中加入悬浮剂和展着剂，获得液体菌剂。

上述菌剂制备方法中的振荡培养的条件为：在摇床上转速180r/min，温度28℃，培养时间2～3d。

上述菌剂在防治农作物菌核病、灰霉病、枯萎病和根腐中的应用。

本技术通过原生质体转化，将寄生相关基因-脂滴包被蛋白基因Per3转入粉红螺旋聚孢霉HLD-1菌株中，获得了转脂滴包被蛋白基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株，该重组菌株Cr-per44抗病性能强、防效稳定，能够有效防治农作物菌核病和灰霉病，同时对枯萎病、根腐等多种植物真菌病害也有较好的防治作用。

附图说明