[发明专利]用于制备磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑3(GPC3)单抗的人工半抗原、制备方法及获得的单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及医学免疫检测技术，特别是用于制备磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)单抗的人工抗原、制备方法及获得的单克隆抗体。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是目前全世界发病率很高的第五大癌症，我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。目前外科手术切除肿瘤仍是治疗HCC最好、最快捷的方法。然而，大多数患者就诊时已失去了最佳治疗时机，能够早期手术切除者只占10-20％，即使手术切除，复发率仍很高。所以早期发现、早期诊断、早期治疗HCC是提高患者生存率的关键，也是预后和治疗的关键。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)，其基因位于人染色体X26q1,长900kb,GPC3开放阅读框有1740bp,编码580个氨基酸，分子量为66kD。GPC3基因编码的蛋白属于硫酸已酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPGs)，通过糖基磷脂酰蛋白(glycosyl-phosphatidylinositol anchor,CPI)锚定在细胞表面，可结合生长因子等，调控着细胞生长、繁殖、分化、黏附和迁移等行为。研究证实GPC3蛋白在肝癌组织中高表达，而在非癌组织中没有表达或表达极少，并能在血中检测到。用免疫组化的方法检测GPC3阳性者在80％以上。而其他良性肝病和正常肝组织中表达率为0，其特异度应在90％以上。另外，GPC3在对于小肝癌在血清中的检出率明显高于AFP，两者分别是56.3％和31.3％。因此，GPC3对HCC的诊断率明显高于AFP，尤其在AFP阴性的早期肝癌的诊断中发挥重要作用。

另外，GPC3对于肝癌而言或许不仅仅可以用于诊断，在肝癌的治疗方面也有所帮助。由于GPC3在肝癌中高度特异性的表达，因而可以将其作为一种肝癌免疫治疗的靶点，选择一种对GPC3有高度亲和力的载体，通过该载体将能杀伤癌细胞的物质如化疗药、放射性核素、毒蛋白等运送到肿瘤靶细胞，从而可以对该肿瘤靶细胞产生选择性的杀伤作用。

然而，目前市场上销售的商品化的GPC3抗体多为多克隆抗体，活性较低且试验结果很不稳定，直接影响到实验研究的深入开展及在肝癌治疗中的应用。

发明内容

本发明根据上述领域的空白和需求，提供用于制备磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)单抗的人工抗原、制备方法及获得的单克隆抗体。

一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3人工半抗原，其特征在于，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。

所述的人工半抗原在制备磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3单抗中的用途。

一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用抗原免疫动物，

(2)细胞融合，

(3)单抗筛选，

(4)腹水制备和抗体纯化；

其特征在于，所述抗原为氨基酸序列如Seq ID No.1所示的多肽与匙孔血蓝蛋白偶联而得的偶联物。

一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的单克隆抗体，其特征在于，是采用所述的人工半抗原与匙孔血蓝蛋白偶联而得的偶联物为免疫原制备筛选而得。

所述的单克隆抗体，是保藏号为CGMCC No.10315的杂交瘤细胞所分泌。

一株分泌磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CGMCC No.10315。

一种用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的免疫检测试剂盒，其特征在于包括捕捉抗体，所述捕捉抗体为所述的单克隆抗体。

一种用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的蛋白质印迹试剂盒，其特征在于，包括针对检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的探针，所述探针为所述的单克隆抗体。

上述的单克隆抗体在肝癌细胞研究中的用途。

本发明的发明思路基于下述三方面的考虑。第一，GPC3广泛表达于肝癌细胞表面，是肝癌早期诊断和靶向性治疗的主要的标靶；第二，市场上销售的商品化GPC3抗体多为多克隆抗体，并且效价极不稳定，直接影响到科学研究的深入开展及在肝癌治疗中的应用；第三，我们选择多个抗原表位进行多肽合成、动物免疫、杂交瘤融合及腹水制备等抗体制备方法结合实际的科研实验进行验证，从而大大提高抗体制备效率。

基于本发明的成果，本发明请求保护用于制备单抗的人工抗原，其氨基酸序列如Seq IDNo.1(选自来源于NP_004475.1的一段)所示。本发明还请求采用该人工抗原制备单抗的方法，以及获得的单抗，单抗的用途即采用该单抗的试剂盒。