[发明专利]羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于羊的泰勒虫病检测技术领域，具体涉及一种羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条及其制备方法。

背景技术

尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫（Theileria uilenbergi& T. luwenshuni）属于原生生物界（Protista）、顶复门（Apicomplexa）、孢子虫纲（Sporozoea）、梨形虫亚纲（Piroplasmia）、梨形虫目（Piroplasmida）、泰勒科（Theileriidae）、泰勒虫属（Theileria），是引起羊的泰勒虫病的病原。青海血蜱和长角血蜱是该病的传播媒介。羊的泰勒虫病在我国分布广，目前已在四川、青海、甘肃、辽宁、内蒙古、山西、宁夏、新疆、河南、湖北等地检测到了病原或抗体。尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫的混合感染较为常见，感染常引起动物高热、贫血、黄疸、呼吸困难、消瘦等特征性临床症状。该病为地方性流行动物疫病，它的流行必需同时具备病原，传播媒介蜱和宿主动物三个要素。该病在易感动物初次接触时易造成爆发，导致动物死亡而造成巨大的经济损失，而且该病疫源地限制了羊种的引进，成为了制约当地养羊业发展的主要因素之一。

目前，羊泰勒虫病的诊断主要有以下几种方法：（1）传统的诊断方法。如：临床症状观察、血涂片镜检、淋巴结穿刺法，取淋巴液，制涂片，镜检等。动物发病时，其临床症状为发热、食物不振、呼吸困难、淋巴结肿大等，血涂片镜检时红细胞内可见虫体（Yin, H., et al. Parasitol Res (2003) 91, 34–39）。传统方法操作人员需具有丰富专业知识和实践经验，而且这些方法只能诊断处在急性发病期的羊。（2）基于核酸检测的病原学检测技术。如PCR (Yin, H.,et al. Transbound Emerg Dis. (2008) 55:233-7)、反向线性印迹杂交技术（RLB）（Schnittger, L., et al. Parasitol Res ( 2004)92:189-96）和成环介导等温扩增法（LAMP）（Liu, Z.,et al. Parasitol Res (2008) 103, 1407-1412）等。这些基于核酸检测的方法，可用于尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫的病原学检测。这些方法需要相应的仪器设备，适用于实验室检测，目前还不能用于临床检查。（3）血清学诊断方法。至今用于我国羊的泰勒虫病血清学检测的方法只有三种酶联免疫吸附试验（ELISA）方法。它们分别为基于虫体裂解物粗抗原（Gao, Y., et al. Parasitol Res ( 2002) 88: S8-10）, 基于rTIHSP 70重组蛋白抗原（Miranda, J., et al. Parasitol Res (2006) 98: 561–567）和TuIP重组抗原（Liu, Z., et al. Int J Parasitol (2010) 40, 591–598）的间接ELISA方法。ELISA方法的应用需要相关仪器设备和较强的专业知识，检测耗时较多，适用于实验室检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中的缺点而提供一种操作简单、快速、价廉等优点，它不但可以用于实验室快速检测，也可以用于临床现场检测的羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条。

 本发明的另一目的还提供上述羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条的制备方法。

为解决本发明的技术问题采用如下技术方案：

一种羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条，包括PVC垫，所述PVC垫上表面依次排列用于待检样品上样的样品垫、包被有金标记的尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫的一端设在胶体金垫的一端上方，所述胶体金垫的另一端设在硝酸纤维素膜的一端上方，所述吸水垫的一端设在硝酸纤维素膜的另一端上方；所述硝酸纤维素膜上分别包被有尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原的检测线和多克隆抗体的质控线。

上述羊的泰勒虫病免疫胶体金检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

a. 制备尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原：

采用基因克隆技术聚合酶链式反应PCR扩增出尤氏泰勒虫TuIP基因片段后，与载体连接并转化到感受态细胞中使其表达，得到尤氏泰勒虫TuIP蛋白抗原；

 b. 硝酸纤维素膜的点样：

在硝酸纤维素膜检测线上包被尤氏泰勒虫TuIP重组蛋白抗原，同时在硝酸纤维素膜质控线上包被抗尤氏泰勒虫TuIP多克隆抗体，晾干；

c. 制备胶体金：