[发明专利]一种EphrinB2高表达的重组HEK293细胞及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及EphrinB2高表达的非癌细胞的构建，特别涉及一种基于外源重组质粒的EphrinB2高表达的重组HEK293细胞及其应用。

背景技术

酪氨酸激酶受体(RTK)是一个庞大的家族，在生物体的生命活动中担当着非常重要的作用。RTK的胞外区是结合配体结构域，配体是可溶性或膜结合的多肽或蛋白类激素，包括胰岛素和多种生长因子。胞内段是酪氨酸蛋白激酶的催化部位，并具有自磷酸化位点。当配体与RTK结合后，能诱导受体构象变化，导致受体发生稳定的二聚化，二聚化的受体发生磷酸化，在受体激酶区内形成含有磷酸化酪氨酸位点的基序，并伴有PTK的激活。酪氨酸特异的磷酸化使激酶区稳定在激活的构象，并为下游含有src癌基因家族SH2区和结合磷酸化酪氨酸的功能区(phosphotyrosine binding domain,PTB)的信号转导分子提供识别、停靠和结合的部位。PTK通过启动细胞内的信号通路调节细胞的生长、分化、运动、变形和代谢等，导致多种效应。

Eph是属于目前已知最大的蛋白酪氨酸激酶受体家族(RTKs)亚族，包括Eph受体及其Ephrin配体。EphB4与EphrinB2在信号传递时表现出独特的方式，可互被对方激活，产生“正向信号”和“反向信号”，以EphrinB2激活EphB4等信号通路为正向信号；而EphB4激活EphrinB2为反向信号。EphB4/EphrinB2及其独特的双向信号转导几乎参与血管生长的每个方面。EphrinB2可能在VEGF信号通路中扮演一个总调控者的角色，并在血管生长中发挥核心作用。Eph/Ephrin家族是受体酪氨酸激酶家族中的最大亚族，根据配体结构不同分为两种亚型：固定于胞膜上的称为EphrinA亚型，共5种；而3种B亚型的Ephrin配体则属于跨膜蛋白(Cell,1997,90(3):403-404)。根据同源序列将Eph受体也分为两组:EphA和EphB受体。Eph受体由跨膜域、细胞外配体识别域和半胱氨酸域组成，半胱氨酸域中含有一个位于细胞内侧的PDZ结合域；Eph跨膜蛋白位于细胞外负责识别细胞环境中信号的结构域可以与Ephrin发生作用，形成多聚体的形式，因而导致Ephrin配体和Eph受体的活化，从而影响细胞相互作用及细胞迁移等功能(Cur Opini Cell Bio,2010,22:611-616)。

肿瘤的发生、发展和转移依赖于肿瘤血管形成，只有在新生血管形成以后，肿瘤才能迅速生长，并进一步向周围浸润和进入血液循环向远处转移，而Eph/Ephrin信号转导是胚胎生长、血管生长和发生过程的重要细胞形态学调控因素，Eph/Ephrin家族中的数个配体和受体已经证实参与了肿瘤生长过程(Cancer Cell,2010,17:533-534)。

创新药物研究与开发是国家科技计划中的重大研究领域，抗肿瘤药物靶向筛选是新药筛选的一个重要方向和领域。目前，寻找靶标开发抗肿瘤药物己成为治疗恶性肿瘤生长和转移的重要手段之一。在肿瘤细胞抑制剂的研发中，尚没有对EphrinB2有一定的抑制作用药物。以EphrinB2为靶点，寻找靶向于肿瘤中EphrinB2的药物会成为研发抗肿瘤药物的重要途径之一。目前对EphrinB2基因的研究较多，但对全长序列EphrinB2载体的构建及生物学应用研究及其应用未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种EphrinB2高表达的重组HEK293细胞及其应用，在构建EphrinB2全长基因的表达载体的基础上，转染HEK293细胞，获得稳定、高表达EphrinB2分子的重组HEK293细胞株，能够用于以EphrinB2为靶点的药物的筛选。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种EphrinB2高表达的重组HEK293细胞，该重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含EphrinB2全长基因的表达载体。

所述的EphrinB2全长基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述的包含EphrinB2全长基因的表达载体是pEZ-M61-EphrinB2，其中pEZ-M61-EphrinB2是将EphrinB2全长基因克隆到载体pEZ-M61中。

所述的pEZ-M61-EphrinB2的引物序列为：

上游引物：5-TCATCTTCATCGTCATCATCATC-3

下游引物：5-CTGTCCGCAGTCCTTAGC-3。