[发明专利]人多能干细胞向生殖细胞分化的无动物源组分培养方法有效
| 申请号： | 201510094574.4 | 申请日： | 2015-03-03 |
| 公开（公告）号： | CN104726400B | 公开（公告）日： | 2018-02-23 |
| 发明（设计）人： | 王媛;赵云程;马庆;孔睿佼;龚雪萍 | 申请（专利权）人： | 华东师范大学 |
| 主分类号： | C12N5/076 | 分类号： | C12N5/076 |
| 代理公司： | 上海麦其知识产权代理事务所(普通合伙)31257 | 代理人： | 董红曼 |
| 地址： | 200062 上*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 多能 干细胞 生殖细胞 分化 动物 组分 培养 方法 | ||
1.一种人多能干细胞向生殖细胞分化的无动物源组分培养方法，其特征在于，在无血清、无动物源性蛋白培养液的条件下，使男性来源多能干细胞在体外分化过程中产生类精原干细胞、单倍体细胞，其中，所述男性来源多能干细胞不直接来源于胚胎；其中，所述无血清、无动物源性蛋白培养液为无血清、无动物源性蛋白培养液II：
所述无血清、无动物源性蛋白的培养液II包括：
MEM培养基；
青霉素/链霉素双抗溶液 1％；
L-谷氨酰胺 2mM；
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 10mM；
胰岛素-转铁蛋白-硒-X添加物 1％；
无异源成分的血清替代物 0.2-3％；
碱性成纤维细胞生长因子 1ng/mL；
重组人神经胶质源神经营养因子 10-40ng/mL；
维生素C 50-200ug/mL；
脂质浓缩物 0.1-0.2％。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，当男性来源多能干细胞生长达到培养皿生长面积90％汇合状态时，使用所述无血清、无动物源性蛋白的培养液。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法在37℃、5％CO2饱和湿度条件下进行。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法中，男性来源多能干细胞培养8～25天可得到类精原干细胞、单倍体细胞。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述类精原干细胞为VASA阳性、PLZF阳性、GPR125阳性、CD90阳性,且H19印记基因上游区域高度甲基化类的精原干细胞；所述单倍体细胞为Acrosin阳性、Prm1阳性,及H19印记基因上游区域高度甲基化的单倍体细胞。
6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述方法在男性来源多能干细胞分化过程中无饲养层细胞。
7.一种无血清、无动物源性蛋白培养液，其特征在于，为无血清、无动物源性蛋白培养液II，其包括：
MEM培养基；
青霉素/链霉素双抗溶液 1％；
L-谷氨酰胺 2mM；
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 10mM；
胰岛素-转铁蛋白-硒-X添加物 1％；
无异源成分的血清替代物 0.2-3％；
碱性成纤维细胞生长因子 1ng/mL；
重组人神经胶质源神经营养因子 10-40ng/mL；
维生素C 50-200ug/mL；
脂质浓缩物 0.1-0.2％。
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