[发明专利]多重PCR检测肠道新发原虫试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业和动物检疫技术领域，具体涉及一种隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫的检测方法，尤其涉及一种隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫的多重PCR检测方法及试剂盒。此外，本发明涉及用于同时检测隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫的引物。

背景技术

隐孢子虫、蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)、环孢子虫和微孢子虫为人兽共患新发肠道原虫，主要介水传播，引起消耗性腹泻，是全球面临的重要公共卫生问题，也是人类迄今为止面临的最困难的问题之一；可暴发流行，造成严重的突发公共卫生事件。人的感染主要是摄入被卵囊/包囊等污染的饮水和食物，引起的疾病以腹泻为主要临床症状，呈全球分布，也是艾滋病患者死亡的主要病因之一。免疫功能正常人群感染，常可引起急性、自限性腹泻，婴幼儿、免疫功能缺陷或免疫抑制人群感染，可引起慢性消耗性腹泻，甚至死亡。该类疾病可从动物传播到人，人传播到动物，并在动物与动物、人与人之间广泛传播，造成重大经济影响。每年全球有250万5岁以下的儿童因包括肠道原虫在内的肠道病原体感染引起的腹泻而死亡。我国隐孢子虫感染率0.5％～13.5％，贾第虫为2.52％，环孢子虫为0.3～10.6％，其中临床腹泻患者环孢子虫感染率为1.71～2.47％；上海某医院腹泻患者微孢子虫的感染率高达13.49％。其中隐孢子虫病已被WHO列入全球六大腹泻病之一，于1986年将隐孢子虫作为AIDS(艾滋病)患者的一项怀疑指标，并被WHO和美国CDC列入新发传染病，隐孢子虫病越来越引起关注，已被列为美国政府生物恐怖制剂名单的第三位(http://www.nsf.org/consumer/bioterrorism/bioterrorism_agents.asp)，也是其中唯一一种寄生虫病原。隐孢子虫、环孢子虫是美国FoodNet食源性疾病监测十大病原之一，位列第二和第九位；而隐孢子虫和贾第虫是我国《生活饮用水卫生标准》水质必检指标之一，也是我国国家科技重大专项——国家传染病监测技术平台监测的病原。另外，2013年春夏之交，美国暴发了因食物污染引起的环孢子虫病，遍布25个州643人感染；且90％以上的环孢子虫感染与食物污染有关。

有资料显示水中只要含有1个卵囊就可引起隐孢子虫病传播流行。但是国内由于对其研究起步较晚，基本仍采用形态学检测，易漏检、误检。快速检测工具的缺乏，无检测试剂盒，更无高通量检测技术，严重制约了对这类新发肠道原虫的监测和研究。

随着分子生物学技术的发展，基于不同的分子标识，可实现对该类肠道原虫的检测和鉴定。但单一虫种检测，成本昂贵，费时费力。自1988年Chamberian首次将多重PCR(Multiplex PCR)技术用于人的杜氏营养不良症(DMD)的检测，现已用于传染病的检测。目前，应用多重PCR技术对感染性疾病病原检测主要有两个方向：一是针对每一种病原的单个特异基因进行多重检测，可同时检测一种或几种病原体是否存在；二是针对某一病原的多个基因进行多重检测，可以减少假阳性结果的出现。

Lee等建立了一种检测水中隐孢子虫，微孢子虫和环孢子虫的多重PCR检测方法(Lee,S.H,Joung,M,Yoon,S,et al.Multiplex PCR detection of waterborne intestinal protozoa:microsporidia,Cyclospora,and Cryptosporidium.Korean J Parasitol,2010,48(4):297-301)，该方法的最低检出率是10-100个卵囊或子孢子；Li等建立了用于检测隐孢子虫和贾第虫的两重PCR方法(Li W,Zhang N,Gong,P,et al.A novel multiplex PCR coupled with Luminex assay for the simultaneous detection of Cryptosporidium spp.,Cryptosporidium parvum and Giardia duodenalis.Vet Parasitol,2010,173(1-2):11-18)，并与Luminex液相芯片检测技术相结合，并能检测出微小隐孢子虫，该方法的敏感性可检测至5*10^-6ng DNA(即0.1个卵囊/包囊)。目前尚无同时检测粪便样本中隐孢子虫、微孢子虫，环孢子虫和贾第虫四种原虫的多重PCR方法。

发明内容