[发明专利]利用人工合成MV1序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种培育甘蔗抗病品种的方法，具体涉及一种利用人工合成MV1序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，属于生物技术领域。

背景技术

甘蔗(Saccharum officinarum)是禾本科甘蔗属植物，是我国最主要的糖料作物和绿色能源作物，其生产不仅关系我国食糖安全，还能为绿色能源燃料乙醇的生产提供原料。但在实际生产过程中，甘蔗病虫害等许多因素都制约甘蔗的生产，致使甘蔗生产遭受巨大的经济损失。甘蔗花叶病是蔗区发生最普遍、危害最严重的甘蔗病害之一，它主要破坏甘蔗叶片的叶绿体，严重制约其光合作用，从而使甘蔗的生长受到限制，造成产量降低5％-19％、节间变短、品质变劣和品种退化。

甘蔗花叶病是由马铃薯Y病毒属(Potyvirus)甘蔗花叶病毒亚组的成员甘蔗花叶病毒(Sugarcane Mosaic Virus,ScMV)和高粱花叶病毒(Sorghum Mosaic Virus,SrMV)引起的。Potyvirus病毒基因组长约10kb，编码一个多聚蛋白，经自身编码的蛋白酶降解形成10个多肽，分别为P1、HC-pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、Nib和CP。近年来，研究者先后将单一的CP及HC全序列基因导入到甘蔗中，并获得了转基因甘蔗，对甘蔗花叶病的抗性明显提高。但研究表明，蔗区中花叶病毒的优势株系在自然条件下也会发生变化，并产生新的株系。目前，世界蔗区至少存在有7个ScMV和SrMV病毒株系，包括属于ScMV的株系ScMV-A,B,D,E和属于SrMV的株系SrMV-H,I,M。因此，仅以单一株系的花叶病毒的单一基因为靶标的转基因改良显然无法应对蔗区病原株系多样化、复杂化以及优势株系的变化。

近年来，基于RNAi(RNA interference)原理的抗病毒育种受到了广泛的关注，因为由dsRNA(double-stranded RNA)诱导的降解同源RNA而造成的基因沉默现象广泛地存在于生物体中，将任何目的基因序列插入RNA干扰载体，可获得沉默靶标基因的效应。而且，引发RNAi的片段并不需要完整的基因序列，还可以是多个病毒的不同基因片段的嵌合体，因此，RNAi针对的靶标基因也可以是多个不同病毒的基因片段。为此，我们将收集到的ScMV各病毒株系的核酸序列和SrMV各病毒株系的核酸序列分别进行多序列比对，从中分别选取5条和10条长度大于21bp且100％同源的序列区段，采用人工合成的方式串联在一起，作为RNAi(RNA interference)干扰片段，构建反向重复序列，得到一个RNAi载体。通过基因枪轰击法遗传转化甘蔗，获得具有沉默病毒基因表达效果的转基因甘蔗。

专利号为ZL20071009226.8的发明专利“利用SrMV-P1基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法”，介绍了一种利用SrMV-P₁基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括SrMV-P₁基因的克隆、抗花叶病甘蔗转P₁基因植物表达载体的构建、抗甘蔗花叶病转P₁基因材料的培育以及抗病高产高糖转基因甘蔗新材料的筛选鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用人工合成序列MV1培育抗花叶病甘蔗品种的方法。针对现有蔗区甘蔗花叶病严重的问题，人工合成可同时沉默甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒的新型核酸序列，构建RNAi载体，通过基因枪轰击法进行遗传转化，获得对花叶病高抗的转基因甘蔗。

本发明的目的是通过以下方法实现的。

本发明的利用人工合成MV1序列培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括MV1序列的人工合成、RNAi干扰载体构建、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定；其特征在于：

(1)MV1序列的人工合成：

从ScMV和SrMV核酸序列中选取若干区段串联在一起，获得MV1序列，同时在正义链5′端加入Xba I和Xho I酶切位点，反义链5′端加入Cla I和Kpn I酶切位点，采用人工合成的方式，获得目的片段A，其序列如下：