[发明专利]一种乳腺癌miRNA检测试剂盒及其miRNA的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种miRNA的检测产品以及miR-21、miR-191和miR-16作为乳腺癌分子标记物的应用，属于生物技术领域。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，全世界每年约有200万新增乳腺癌患者；我国近年乳腺癌发病率增长迅速，高出发达国家1-2个百分点，且具有年轻化、家族聚集、遗传易感等特征。乳腺癌早早期时临床无症状，隐匿阶段平均为12年，等到有明显症状时多已是中晚期。

应用分子指标来早期发现肿瘤是目前的研究热点，其中微小RNA(microRNA，miRNA)作为早期诊断的新一代肿瘤标志越来越引起临床应用的关注。miRNA是一类高度保守，长度约在19－24个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA,能通过与靶基因mRNA特异性的碱基互补配对,引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译,从而参与调控细胞增殖、分化及凋亡过程，一些miRNA作为原癌基因或抑癌基因已被证实。Iorio等的研究(Cancer Res，2005，65(16)，7065-7070)首次指出，miRNA在乳腺癌和正常的乳腺组织中的表达存在着明显的差异。Seongho等的研究(Plos one，2011,6(2)，e16403)利用Illumina-Sol-exa深度测序平台的基因检测技术在乳腺癌细胞株中鉴定的189种明显异常的miRNA，这些miRNA均有不同程度的致癌潜能。miRNA对于早期癌症的诊断具有重要意义。Mar-Aguilar F的研究(Asia Pac J Clin Oncol.2013，9(1):53-9)显示miRNA的联合表达分析比起单个miRNA分析在预测乳腺癌中的优势：miR-125b和miR-191的联合检测敏感度为100％，特异性为94％；miR-21和miR-191联合检测敏感度为92％，特异性为100％。“miR-21、miR-155在乳腺癌血清和肿瘤组织中表达水平相关性的研究”(卞国奉，2012，硕士论文)也指出血清中miR-21和miR-155联合检测在乳腺癌早期诊断中的潜在价值。

血清中的miRNA含量远低于组织，需要一种非常灵敏且特异的检测方法；又由于miRNA引物序列短，引物设计比较困难，没有针对性的软件可以直接利用，故引物及体系均需筛选及优化过程。目前对miRNA的高通量筛查一般采用芯片技术，成本高、特异性和灵敏度有限，且不能满足零散标本实时检测需求；对少数miRNA的实时检测多采用Taqman探针法，部分已形成商业化试剂盒产品，但成本和售价高昂。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测快速方便、准确率高，可以实现乳腺癌早期诊断的miRNA检测试剂盒，以及提供miR-21、miR-191和miR-16联合使用作为乳腺癌分子标记物的应用。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：miR-21、miR-191、miR-16和miR-39联合使用在制备乳腺癌miRNA检测试剂盒中的应用，其中miR-39作为内参。

基于上述应用本发明提出的具体技术方案是：一种乳腺癌miRNA检测试剂盒，其检测体系包括反转录反应体系、RCR反应体系和内参体系，所述RCR反应体系中包括分别针对miR-21、miR-191和miR-16的正向引物和反向通用引物；所述内参体系包括内参miRNA-39和针对miR-39的正向引物；针对所述miR-21的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；针对所述miR-191的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；针对所述miR-16的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；针对所述miR-39的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

用于配制所述RCR反应体系的试剂包括SYBR Green混合液、正向引物液、反向通用引物液和纯水；用于配制所述反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶纯水。

上述RCR反应体系的总体积为10μl；其中，所述SYBR Green混合液的体积是5μl，所述正向引物液的体积是1μl，所述反向通用引物液的体积是1μl，所述DNA模板1μl,其余是纯水；所述正向引物液的使用浓度为2μM，所述反向通用引物液的使用浓度为2μM；所述DNA模板是所述反转录反应体系反应后的产物稀释五倍获得的。