[发明专利]一种优化冻干溶藻细菌NP23菌粉保护剂的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物法防治水华和赤潮技术领域，具体涉及一种优化冻干溶藻细菌NP23菌粉保护剂的方法。

背景技术

随着我国经济的发展和城镇化进程的加快，未被处理的工农业废水和生活污水的排放逐年增加，导致受纳水体的富营养化呈加重趋势。在2008年国家环保局监测的26个湖(库)中有14个呈现不同程度的富营养化，占53.8％，而城市内湖的富营养化达到了100％。造成的直接后果是水质恶化、水味腥臭难闻、藻类过量繁殖、生物多样性下降、水华频繁发生，不仅丧失了景观功能，甚至危害到居民健康。因此寻求有效的水华防治途径势在必行。而常规的治理方法例如化学法和物理法在应对有害藻华时效果不甚理想,在此情况下，利用溶藻菌控藻成为防治水华和赤潮的可能手段，引起了众多科研人员的关注。国外对溶藻细菌的研究已经有几十年的历史，国内的相关研究虽起步较晚，但也取得了一定的研究进展。目前主要集中在溶藻菌种类和溶藻效果的研究、溶藻机理和溶藻物质的研究等，但对如何优化溶藻菌菌粉保护剂配方的研究不多。

本研究用Plackett-Burman(PB)法筛选出影响溶藻菌NP23(从河南省平顶山市白龟山水库大坝下游水体中分离、筛选到一株具高效溶藻能力的细菌)真空冷冻干燥存活率3个重要保护剂(蔗糖、明胶和甘油)，然后对筛选出的重要因素在最佳值区域里用响应面方法(response surface methodology，RSM)拟合因素与结果间的全局函数关系，从而得到准确有效的一个稳定的工艺条件。优化后最大限度地发挥保护剂的保护功能,减少菌体在冷冻干燥过程中的死亡,提高细胞的存活率。开发高效冻干保护剂，为溶藻细菌的保存，运输和使用提供便利，对治理日益严重的水体富营养化具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种优化溶藻菌NP23菌粉保护剂配方工艺，克服了现有技术中没有相关优化溶藻菌NP23菌粉保护剂配方工艺的不足。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种优化冻干溶藻细菌NP23菌粉保护剂的方法，通过以下步骤完成：

1)测溶藻菌NP23在发酵罐的生长曲线及浓度；

2)采用Plackett-Burman法筛选出影响溶藻菌真空冷冻干燥存活率的重要因素；

3)筛选出的重要因素在最佳值区域里用响应面方法(response surface methodology，RSM)拟合因素与结果间的全局函数关系，确定最佳配比条件；

4)检测优化后溶藻菌NP23真空冷冻干燥保护剂菌粉的溶藻效果。

进一步，

步骤(1)中具体通过分光光度计在660nm波长处测菌液OD值绘制发酵液中溶藻菌生长曲线，确定对数生长期，所采用的培养基为MRS培养基。

步骤(2)中影响溶藻菌真空冷冻干燥存活率因素为蔗糖、葡萄糖、明胶、脱脂乳、海藻糖、MnSO₄·H₂O、甘油或谷氨酸钠中的一种或几种；

细胞存活率的计算方法为：

细胞存活率＝(冻干后1g样品中测得的活菌数×粉剂重量)/(冻干前1mL样品中测得的活菌数×混悬液体积)×100％

步骤(3)筛选出的重要因素为蔗糖、明胶和甘油，且保护剂中蔗糖与明胶与甘油的重量比为4.85:3:2.84。

步骤(4)检测方法为按菌藻1:9的接种量投入到对数生长期的栅藻的藻液中，每隔12h测定叶绿素a含量，计算出冷冻干燥NP23菌液对栅藻的溶藻率；

本发明保护剂制备冷冻干燥菌液的具体做法是：10℃离心收集菌体，加入一定体积无菌水，调菌浓至1×10¹⁰CFU/ml，取菌液加入制备好的保护剂中，保护剂与菌液的体积比为3:1。

本发明利用真空冷冻干燥技术生产活菌制剂是多种保藏方法中较为理想的一种。单一的保护剂并不能满足冷冻干燥的要求，所以抗冻保护剂一般都是按一定配方混合使用。只有复配保护剂中各保护剂的比例及浓度达到协调时,才能达到最佳的保护效果。响应面方法(response surface methodology,RSM)是一种有效的多变量系统寻优的试验策略，通常和Plackett-Burman设计联用来实现对某种配方或工艺关键控制参数的筛选和优化，在试验设计与结果表述方面更加优良。本实验用Plackett-Burman法和响应面方法拟合因素与结果间的全局函数关系，得到准确有效的一个稳定的工艺条件。