[发明专利]猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR检测方法及其引物和TaqMan探针

说明书

技术领域

本发明涉及猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR的引物、TaqMan探针及其应用。

背景技术

猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种高度接触传染性肠道疾病，临床上以病猪呕吐、严重腹泻和失水为主要特征，不同品种、年龄的猪只都可感染发病，尤以两周龄以内仔猪、断奶仔猪易感性最强，致死率可高达100％。该病是一种世界性疾病，给畜牧业生产带来巨大的经济损失，早发现、早确诊对该病的防治意义重大。

目前，检测TGEV的常规检测方法主要包括以下几类：

1.病原学检测，如病毒的分离鉴定、电镜检测、免疫荧光法和免疫过氧化物酶法等，但病原学检测在实际的生产和应用中存在较多局限，如TGEV的病毒通常的分离通常只能在具有先进配置的实验室进行周期长，且还需通过其它检测手段进行鉴定，而免疫荧光法和免疫过氧化物酶法等同样存在操作过程复杂、耗时长等问题。

2.血清学检测，如血清中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、检测免疫球蛋白特异性抗体的间接免疫过氧化物酶试验等。血清学检测通常是采用间接鉴定，即需先制备TGEV病毒的抗体，所以存在着较严重的非特异性或漏检等问题。

3.分子诊断技术，包括：核酸探针杂交技术、聚合酶链式反应(RT-PCR)技术、多重RT-PCR、RT-nPCR和荧光定量PCR等方法。PCR操作简便，可以判定样品中是否有TGEV的存在，这种方法较已知的、传统的血清学和免疫学方法的优势在于可以免去病毒分离过程，快速准确，有较高的特异性和敏感性。

目前TGEV的荧光定量PCR检测方法，如CN201110068834.2提供的“猪传染性胃肠炎病毒S基因荧光定量PCR检测方法及其引物”以及CN201110068834.2提供的“一种猪传染性胃肠炎病毒的S基因SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法”。该两检测方法针对的均是TGEV病毒的S基因的两步法，即先反转录再进行荧光定量PCR反应。两方法针对的是TGEV的S基因，S蛋白基因抗原性较强，保守性较低，针对该S基因设计的引物的通用价值低，且该两方法采用的是特异性相对较低的SYBR Green Ⅰ染料探针。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供特异性更高的，操作更简便的猪传染性胃肠炎病毒N基因的RT-qPCR检测方法及其试剂盒。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一组猪传染性胃肠炎病毒N基因的引物和TaqMan探针，包括：

如序列表SEQ ID No.1所示的猪传染性胃肠炎病毒N基因的上游引物；

如序列表SEQ ID No.2所示的猪传染性胃肠炎病毒N基因的下游引物；

如序列表SEQ ID No.3所示的猪传染性胃肠炎病毒N基因的TaqMan探针序列。

作为优选，所述TaqMan探针序列的5’端标记报告荧光基团为FAM，3’端标记淬灭荧光基团为TAMRA。

一种猪传染性胃肠炎病毒N基因的RT-qPCR检测试剂盒，包括上述猪传染性胃肠炎病毒N基因的上游引物、猪传染性胃肠炎病毒N基因的下游引物以及猪传染性胃肠炎病毒N基因的Taq Man探针。

作为优选，还包括：

1)阴性对照；

2)阳性标准质粒：由猪传染性胃肠炎病毒N基因克隆到质粒载体pMD18-T上而获得。

利用权利要求上述RT-qPCR检测试剂盒非诊断性检测猪传染性胃肠炎病毒N基因的方法，包括以下步骤：

1)提取样品RNA；

2)对提取样品的RNA进行RT-qPCR扩增；

3)根据RT-qPCR反应体系的荧光信号进行结果判定。

作为优选，步骤2)中，RT-qPCR扩增反应体系：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μL，Ex Taq HS 0.5μL，RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5μL，如SEQ ID No.1所示的上游引物0.75μL，如SEQ ID No.2所示的下游引物0.75μL，如SEQ ID No.3所示的探针0.25μL，模板2μL，补DEPC水至25μL。

作为优选，步骤2)中，RT-qPCR扩增反应条件：42℃5min，95℃10s；然后按95℃10s，57.5℃10s，60℃35s并收集荧光，进行40个循环。

作为优选，步骤2)中，RT-qPCR扩增反应条件：升降温速度均设置为20℃/s。