[发明专利]用于检测树鼩细小病毒的PCR试剂盒及其专用引物

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域中病毒的检测方法，特别是涉及一种树鼩细小病毒的PCR试剂盒及其专用引物与其在检测树鼩细小病毒中的应用。

背景技术

树鼩细小病毒，文献报道1997年由吴小闲等人从云南中部捕获的野生树鼩肾组织中分离得到的(吴小闲，蒋虹，涂新明，等.树鼩类-细小病毒的初步研究。中国病毒学，1997，12(2)：167-170.)。嗜树鼩肺细胞，在细胞对数分裂期复制，产生细胞病变和血凝素抗原，能凝集豚鼠和小鼠红细胞。电镜负染标本显示该病毒无包膜，近似圆形或六角形，直径约30nm。血清学检查大多数树鼩血清中含有该病毒抗体，证明是树鼩的一种潜在病毒，初步鉴定为树鼩类-细小病毒。

细小病毒分布广，各种动物均有其本种属的细小病毒，有不同的致病性。例如：狗细小病毒引起狗肠炎，成为狗最常见而又危害大的疾病；猫细小病毒引起猫泛白细胞减少症，发生全身症状，死亡率高；大、小鼠的细小病毒常为潜在感染的病毒。本属病毒因能垂直传播，常引起不孕、胚胎死亡、畸形等种种危害。

多数研究显示树鼩与灵长类如人、猴是具有最接近的亲缘关系。树鼩的许多病毒感染特性与灵长类相似，报道显示树鼩能感染人类甲肝、乙肝、丙肝、轮状、疱疹、腺、棒状及副粘病毒等。

目前国内报道的树鼩细小病毒特异性检测方法是病毒的分离和鉴定。国外尚未有报道分离出树鼩细小病毒。此外，目前NCBI网站上尚无树鼩细小病毒基因组序列，国内外尚未报道树鼩细小病毒的分子生物学检测方法。由于树鼩与灵长类亲缘关系较近，在对树鼩细小病毒进行分子生物学检测方法进行研究时可参考猴细小病毒基因序列。

发明内容

针对以上问题，发明人通过对树鼩细小病毒的分子生物学检测方法进行研究，提出了一种PCR检测方法，由于其具有特异性、灵敏度高、快速简便等优点，为将其运用于树鼩细小病毒的早期诊断中提供了一个快速可行的解决方案。

本发明的第一个目的是提供用于树鼩细小病毒PCR检测的引物。

本发明所提供的引物，是以猴细小病毒VP2蛋白基因序列自5’端第4301bp-4800bp区域(序列表中SEQ ID NO：1)为对象设计的，用以检测样品中是否存在树鼩细小病毒污染。

具体来讲，所述引物的上游引物262-F2具有序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，下游引物262-R2具有序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供用于检测树鼩细小病毒的PCR试剂盒。

本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对树鼩细小病毒进行PCR检测的引物。

具体来讲，所述试剂盒还包括25μl PCR反应试剂：HS Taq酶(浓度5u/μl)0.15μl，10×buffer(TaKaRa Taq^TM Hot Start Version DR007A)2.5μl，dNTP(浓度2.5mM)2μl，ddH₂O 17.35μl，上游引物262-F2(浓度10μM)1μl，下游引物262-R2(浓度10μM)1μl。

为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为树鼩细小病毒阳性质粒，所述阴性对照为不含DNA的PCR扩增体系，如双蒸水。

上述PCR引物或试剂盒在树鼩细小病毒PCR检测中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的第三个目的是提供一种树鼩细小病毒的PCR检测方法。

本发明所提供检测方法，可包括以下步骤：

1)提取样本DNA；

2)PCR检测：以步骤1)获得的DNA为模板，在上述专用引物的引导下进行PCR扩增，反应结束后对PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，若能扩增出长度为262bp的目的片段，则检测结果为阳性，反之为阴性。

在上述树鼩细小病毒的PCR检测方法中，所述步骤1)的样本是从树鼩身上分离得到的血液、粪便或肾组织。