[发明专利]一种重组禽流感亚单位口服疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于疫苗制备领域，尤其涉及一种重组禽流感亚单位口服疫苗的制备方法。

背景技术

禽流感，是由禽甲型流感病毒某些亚型忠的一些毒株引起的急性呼吸道传染病。动物禽流感的大规模爆发，不仅给养殖户带来严重损失，也危害到人类的身体健康，同时带来了重大的经济损失。

一般采用动物禽流感疫苗来预防与治疗动物禽流感。

一方面，现有的技术中，一般选取灭活的毒株来制备疫苗。一般用鸡胚生产，病毒适应鸡胚后在鸡胚中的生长，疫苗生产周期长。另外病毒在鸡胚的传代的过程中很容易发生变异，导致疫苗的免疫效果不好。很难达到有效预防的目的。

另一方面，现有的疫苗多采用注射的形式接种，接种复杂，易产生疼痛感，因此，研究一款能够口服的疫苗具有重要意义。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，提供一种重组禽流感亚单位口服疫苗的制备方法，具有免疫效果好、服用方便等优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种重组禽流感亚单位口服疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)构建含有HA基因的重组质粒，将其转染到表达细胞中，进行培养、表达；

2)将步骤1)表达的蛋白进行纯化，获得重组禽流感亚单位颗粒；

3)将步骤2)得到的重组禽流感亚单位颗粒冻干；

4)将步骤3)得到的冻干粉溶解于单磷酰脂质A和氢氧化铝的混合溶液中，混合均匀，得到混合液；

5)将步骤4)得到的混合液，包装，制剂、辐射灭菌，获得重组禽流感亚单位口服疫苗。

进一步，所述冻干粉在混合溶液中的质量分数为1％。所述单磷酰脂质A在混合溶液中的质量分数为0.2％，所述氢氧化铝在混合溶液中的质量分数为0.03％。

本发明的有益效果是：本发明所述一种重组禽流感亚单位口服疫苗的制备方法，通过将冻干粉溶解于单磷酰脂质A和氢氧化铝的混合溶液中，制成禽流感亚单位口服疫苗。不需要注射，紧紧通过口服就可以达到很好的免疫效果。

附图说明

图1为本发明所述一种重组禽流感亚单位口服疫苗对小鼠的免疫效果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明所述的实验方法若无特别说明均采用本领域的常规技术手段，可参见说明书或者分子生物学克隆指南第三版。本发明所使用的实验试剂若无特别说明均为本领域的常规实际，市场上可以购买到。

实施例1培养病毒株A/Anhui/1/2013(H7N9),提取病毒株中的RNA

所述A/Anhui/1/2013(H7N9)来自中国疾控中心(CDC)。

将禽流感病毒株A/Anhui/1/2013(H7N9)取0.2mL接种于15日龄鸡胚，37摄氏度培养40h，置于4摄氏度冰箱过夜，无菌收集尿囊液。取病毒尿囊液500mL4摄氏度条件下6000rpm离心20min收集上清,25000rpm离心2h超速离心，沉淀用5mLTEN重悬，用质量分数10％-40％的蔗糖梯度离心，35000rpm离心2h，收集质量分数30％-35％的病毒带，透析脱糖，用无RNA酶的TE缓冲液悬浮，分装，冻存。

利用QIANGEN Rneasy Mini Kit试剂盒提取RNA，具体操作步骤参见说明书。

实施例2利用反转录PCR获得cDNA

取RNA菌悬液10微升，加入20pmol引物1(如SEQ ID NO：3所示核酸序列)混匀后置于70摄氏度水浴中反应10min，再加入5*反转录酶缓冲液、0.1mol/LDTT2微升、2.5mmol/LdNTP 4微升、RNA酶抑制剂1微升、M-MLV反转录酶10U,37摄氏度水浴1h，97摄氏度作用10min。获得cDNA。

实施例3以获得的cDNA为模板，扩增HA基因

按照如下反应体系配置反应液：